Artículo sobre ...

Respuesta al tratamiento de brucelosis en niños.

Se excluyeron los pacientes con alergia a los antibióticos utilizados como tratamiento y se eliminaron quienes no aceptaron la toma de las muestras sanguíneas y que no completaron el ...

Enviado* el 01/01/2011 19:29
615 Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2007; 45 (6): 615-622 Recibido: 23 de diciembre de 2005 Versión definitiva: 23 de mayo de 2006 Aceptado: 24 de mayo de 2006 Palabras clave brucelosis niños reacción en cadena de la polimerasa técnicas de laboratorio clínico Key words brucellosis children polymerase chain reaction clinical laboratory techniques Evangelina Briones-Lara,1 Gerardo del C. Palacios-Saucedo,2 Irma Olivia Martínez-Vázquez,3 Alberto Morales-Loredo,4 Leticia del Pilar Bilbao-Chávez5 1 Coordinadora Delegacional de Investigación en Salud, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Saltillo, Coahuila 2 Unidad de Investigación Biomédica del Noreste, IMSS, Monterrey, Nuevo León 3 Laboratorio de Inmunología y Virología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León 4 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Monterrey, Nuevo León 5 Servicio de Pediatría, Hospital de Especialidades 25 , IMSS Comunicación con: Evangelina Briones-Lara. Tel y fax: (844) 415 6297. Correo electrónico: Respuesta al tratamiento de brucelosis en niños. Evaluación con reacción de Huddleson y PCR SUMMARY Introduction: brucellosis poses a significant public health problem and requires meticulous      diagnosis; the outcome has frequent relapses even when the treatment is ap- propriate. Objective: To evaluate the response to the treatment in children with brucellosis by means of Huddleson seroaglutination test and PCR. Methods: Using a prospective design, a cohort of children with brucellosis was followed      up by carrying out Huddleson se- roaglutination test of and PCR for Brucella   at 6, 12 and 24 weeks. Most of children were treated with trimetoprim + sulfame- toxazole and rifampicine. The progress towards      therapeutic failure or relapse was evaluated. Results: twenty-three children fulfilled the inclusion criteria. The median age was 4.7 years; 61 % had consumed potentially infected       milk or dairy products. The duration of symptoms ranged from seven days to one year. Brucella sp. was isolated in blood culture in two of 21 children and Brucella      melitensis in myeloculture in one of four children. 69 % had positive Huddle- son serological test from 1:160 to >1:12000. PCR tested positive in 100% of children when entering to the study. Six weeks after beginning treatment 17% of children had therapeutic failure. At twelve weeks, three children (13 %) persisted with positive PCR and their antimicrobial treatment     was modified. At twenty-four weeks, five children (21.7 %) presented relapse. A child persisted positive in spite of modifying    the antimicrobial scheme. The agreement     between the two tests was low in the three follow up periods (? = 0.08, ? = 0.12 and ? = 0.28 respectively). Conclusions. A 6-weeks period treatment cannot be enough to eliminate Brucella . PCR test can be used to early identify re- lapses. RESUMEN Introducción: la brucelosis representa un problema de salud pública y requiere de un diagnóstico minucioso. Produce recaídas    frecuentes aun con tratamiento ade- cuado. El objetivo fue evaluar la respuesta al tratamiento en niños con brucelosis mediante seroaglutinación de Huddleson y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Material y métodos: se siguió con pruebas de seroaglutinación de Huddleson y con PCR para Brucella sp. a las 6, 12 y 24 semanas, a una cohorte de niños con bru- celosis. Se utilizó trimetoprim-sulfametoxa- zol y rifampicina en la mayoría de los ca- sos. Se evaluó la evolución hacia fracaso terapéutico o recaída. Resultados: se ingresaron 23 niños. La mediana en edad fue 4.7 años; 61 % consumió      productos lácteos no pasteurizados. La duración de los síntomas fue de siete días a un año. Se aisló Brucella sp. en he- mocultivo en dos de 21 niños y Brucella melitensis en mielocultivo en uno de cua- tro niños; 69 % tuvo serología positiva (Huddleson) con títulos de 1:160 a 1:12000. En 21/21 (100 %) niños la PCR fue positiva al ingreso al estudio. A las seis semanas, 17 % presentó fracaso terapéutico.      A las 12 semanas, tres niños (13 %) persistieron con PCR positiva y se cambió de antimicrobianos. A las 24 semanas, cin- co niños (21.7 %) presentaron recaída. Un niño persistió positivo a pesar del cambio de esquema antimicrobiano. La concor- dancia entre las dos pruebas fue baja en los tres periodos de seguimiento: ? = 0.08, ? = 0.12 y ? = 0.28, respectivamente. Conclusiones: esta investigación sugiere que el tiempo de tratamiento de seis se- manas tal vez no sea suficiente para la eliminación de la Brucella . Por otro lado, la prueba de PCR puede utilizarse en la detección temprana de recaídas. [email protected]
Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2007; 45 (6): 615-622 616 Evangelina Briones-Lara et al. Huddleson y PCR en brucelosis infantil Introducción La brucelosis representa un problema de salud pública en México.1 La Dirección General de Epidemiología de la Secretaría de Salud notificó   2164 casos para la semana 52 del año 2005. Los estados con mayor incidencia fue- ron Coahuila, Nuevo León, Sinaloa y Gua- najuato.2 La seroprevalencia varía de 0.24 a 13.5 % y a nivel nacional se estima en 3.24 %, pero en áreas endémicas puede llegar a 18.6 %.3,4 Se calcula que el número de casos puede ele- varse de tres a 26 veces debido al importante subregistro, por lo que ascendería de 18 mil a 156 mil casos por año.3,5 En más de 90 % de los pacientes, la bru- celosis suele manifestarse con un cuadro febril que puede comprender un breve pe- riodo, pero dadas las características patogénicas      la enfermedad tiende a mantenerse ac- tiva durante largo tiempo. 1,6-8 En la fase aguda se diagnostica menos de 1 % de los casos,7 por lo que una proporción importante evo- luciona a complicaciones serias (1 a 30 %).6 Cuando la infección tiene más de dos me- ses es capaz de afectar bazo, hígado, médula ósea, o incluso articulaciones y columna vertebral. 6,7,9 Las formas localizadas están ge- neralmente relacionadas con ausencia del or- ganismo en sangre. Esta localización puede ser una manifestación clínica de brucelosis bacteriémica,         por lo que debe considerarse una complicación          y una manifestación crónica. Esto se debe a que Brucella es un organismo capaz de sobrevivir y multiplicarse dentro de las células del sistema fagocíticomononuclear, de ahí que la enfermedad tenga un curso clínico prolon- gado, con recaídas que van de 4 a 41 %.10 El espectro clínico diverso de la brucelosis, sobre todo en la forma crónica, puede hacer que el diagnóstico se pase por alto o se retarde si el médico no tiene alta sospecha de su exis- tencia. Aunque el diagnóstico de la brucelosis humana se basa en la serología y el aislamiento de la bacteria, el diagnóstico definitivo sólo se establece con el cultivo. 11 Sin embargo, la proporción        de cultivos positivos varía entre 15 y 85 %.8 La Norma Oficial Mexicana NOM- 022-SSA2-1994, para la prevención y control de brucelosis en el hombre en el primer nivel de atención establece que el diagnóstico de bru- celosis se realiza por medio de rosa de Ben- gala, aglutinación estándar y 2-mercaptoeta- nol, además de las pruebas confirmatorias de laboratorio (hemocultivo o mielocultivo posi- tivos).5 Aunque los médicos del primer nivel de atención generalmente atienden pacientes en la fase aguda, es importante indicar que en la brucelosis localizada o crónica, tanto las prue- bas serológicas como los cultivos pueden ser negativos. 5,8,9 Además, con excepción de la prue- ba del 2-mercaptoetanol, las pruebas de seroaglutinación            no permiten evaluar el estado de actividad de la enfermedad.7,12 Debido a las limitaciones de los métodos serológicos, sobre todo para la evaluación terapéutica          de la brucelosis, es necesario incor- porar otros que permitan mejorar la exactitud y rapidez del diagnóstico, así como la vigilan- cia de la respuesta al tratamiento. Una alterna- tiva es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mediante la cual se pueden detectar de manera específica y en unas cuan- tas horas, fragmentos del genoma de un orga- nismo. 13-15 El objetivo del presente estudio fue evaluar clínicamente y mediante la seroaglutinación       de Huddleson y PCR, la respuesta al tratamiento en niños con brucelosis. Material y métodos De junio de 1999 a agosto de 2004 una co- horte de niños con diagnóstico de brucelo- sis fue seguida en forma prospectiva por 24 semanas. Los niños recibieron atención en la consulta externa o área de hospitalización     del Hospital Regional de Especialida- des 25 del Instituto Mexicano del Seguro Social en Monterrey, Nuevo León. El pro- tocolo de este estudio fue aprobado por el Comité Local de Investigación y Ética de la unidad. Se dio información detallada a los tutores de los niños acerca de la natura- leza, objetivo y métodos, y se solicitó su consentimiento de acuerdo con los Principios éticos para las investigaciones médicas en seres humanos , de la Declaración de Helsinki. El diagnóstico de brucelosis se estableció con base en la presencia de datos clínicos compatibles         como fiebre, lesiones osteoarticulares (poli o monoartritis, sacroileítis, granulomas
Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2007; 45 (6): 615-622 617 Evangelina Briones-Lara et al. Huddleson y PCR en brucelosis infantil óseos, abscesos), problemas abdominales (he- patoesplenomegalia, hepatitis, granulomas en hígado o bazo), neurológicos (meningitis, en- cefalitis, polineuritis, mononeuritis), respirato- rios (bronquitis crónica) y hematológicos (anemia    hemolítica, pancitopenia). Y por la presencia de dos de los siguientes criterios: pruebas microbiológicas              y serológicas positivas; antecedente de ingesta de alimentos producidos con leches no pasteurizadas o contacto directo con anima- les enfermos o sus desechos. Se excluyeron los pacientes con alergia a los antibióticos utilizados como tratamiento y se eliminaron quienes no aceptaron la toma de las muestras sanguíneas y que no completaron el seguimiento. A cada paciente se le tomaron dos mues- tras de sangre de punciones venosas periféricas    diferentes o una por punción y otra por catéter, para hemocultivo, procesadas en el sistema automatizado BACTEC 9120 (Bec- ton Dickinson Diagnostic Instrument System, Franklin Lakes, NJ USA) siguiendo las reco- mendaciones del NCCLS. Una parte de estas muestras (3 mL) fue utilizada para la  prueba de seroaglutinación de Huddleson siguiendo las instrucciones del fabricante (antígenos fe- briles Interbiol, Interbiol, México). Se consi- deraron como títulos positivos de seroaglutinación         de Huddleson cuando éstos fueron ? 1:160.5 Cuando esta prueba fue positiva a un título > 1:320, se determinó la aglutinación     en una dilución 1:10 del suero proble- ma, por lo que diluciones con aglutinación superiores se multiplicaron por 10. Se llevó a cabo prueba de PCR de la si- guiente forma: Cepas control: el Instituto Nacional de Diagnóstico        y Referencia Epidemiológica proporcionó      cepas de referencia de Brucella abortus, Brucella melitensis y Brucella ovis; la Producto- ra Nacional de Biológicos Veterinarios, las ce- pas vacunales S19 y RB51 de Brucella abortus . Extracción de DNA: se utilizó el método fenol-cloroformo adecuado por Martínez- Vázquez en 1997.16 Reacciones de PCR: s e realizaron en volu- men de 25 ?L, utilizando 10-200 ng de DNA, 25 a 50 pmol de cada uno de los iniciadores,17 200 ?M de cada uno de los 4 desoxinucleótidos    trifosfatados (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD USA), 1 a 3 mM de MgCl 2 , 1X Buffer Taq (200 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8) y 2.5 unidades de Taq-DNA polimerasa (GIB- CO-BRL, Gaithersburg, MD USA). Se utilizó un termociclador modelo Ericomp (Ericomp Inc., San Diego, CA USA) con los siguientes parámetros: 2 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de tres pasos/ciclo como sigue: desnaturalización             a 94 °C/1 minuto, alineamiento de iniciadores a 60 °C/1 minuto y una extensión     a 72 oC/1 minuto con una extensión final de 10 minutos a 72 °C. Reacciones de PCR anidada (Nested-PCR): tomando como templado 2 ?L del producto amplificado por PCR se realizó una Nested- PCR utilizando los iniciadores reportados por Leal-Klevezas y colaboradores.18 Las condicio- nes de la reacción y del programa del termoci- clador fueron las mismas que para la reacción de PCR anterior. Los productos amplificados (5 ?L) fueron fraccionados por electroforesis en geles de agarosa (1.5 % p/v) con un flujo eléctrico de 100 V, se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 ?g/mL) y se fotografiaron con cámara     Polaroid (GelCam DS-34, England, UK) con filtro para luz ultravioleta. La prueba de PCR se consideró positiva cuando se amplificó un fragmento de aproximadamente 200 pares de bases (pb) correspondiente a una porción del gen omp2 de Brucella sp. Todos los pacientes menores de nueve años fueron tratados con trimetoprim-sulfametoxa- zol a 8/40 mg/kg/día vía oral en dos dosis y rifampicina a 20 mg/kg/día vía oral en dos dosis. Los niños de nueve años y mayores fue- ron tratados con tetraciclinas a 30 mg/kg/día vía oral en cuatro dosis al día, rifampicina a 20 mg/kg/día vía oral en dos dosis y estreptomi- cina a 20 mg/kg/día vía intramuscular en una dosis al día, esta última por 21 días. El tiempo mínimo de tratamiento fue de seis semanas. Los signos y síntomas fueron seguidos clínicamente          a las 6, 12 y 24 semanas pos- teriores al inicio del tratamiento. Se consideró     mejoría clínica si remitieron sin evidencia de infección a las seis semanas postratamiento y fracaso clínico si no existió respuesta. Se realizó     seroaglutinación de Huddleson y PCR para Brucella SPP. en el mismo intervalo. Se consideró     como fracaso terapéutico a la persisten- cia de las manifestaciones clínicas de la enfer-
Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2007; 45 (6): 615-622 618 Evangelina Briones-Lara et al. Huddleson y PCR en brucelosis infantil medad o PCR positiva a las seis semanas de tratamiento; y que había recaída en quienes la prueba de PCR se tornó positiva después de haber sido negativa a las 12 o 24 semanas. Los pacientes con fracaso terapéutico continuaron el mismo esquema antibiótico hasta completar 12 semanas. Si persistían positivos, se cambió a 30 mg/kg/día vía oral de ciprofloxacina en dos dosis más 20 mg/kg/día vía oral de rifam- picina a en dos dosis.7,19 Resultados Se atendieron 28 niños con diagnóstico de bru- celosis durante el periodo del estudio; 23 reunieron los criterios de inclusión y cinco no completaron el seguimiento. La media- na de edad fue de 4.7 años (rango dos meses a 14 años); 13 fueron hombres y 10 mujeres (relación 1.3:1) (cuadro I). En 14 niños (61 %) se confirmó el antecedente de ingesta de pro- ductos lácteos no pasteurizados. Seis (26 %) tuvieron diagnóstico serológico de brucelosis al envío. Otros diagnósticos de envío o ingreso fueron síndrome febril (26 %), aplasia medular (8.6 %), meningitis (8.6 %) y hepatitis (8.6 %). La mediana del tiempo de evolución de los síntomas fue de 30 días (rango siete días a un año) (cuadro I). Los signos y síntomas al inicio del padecimiento fueron: fiebre 96 %, ataque al estado general 96 %, hepatomegalia y espleno- megalia 30.4 %, hepatomegalia 4 %, espleno- megalia 8 % y pérdida de peso 26 %. La hemo- globina tuvo una media de 9.86 ± 1.89 g/dL (rango 6.2 a 13.5). La serie blanca tuvo una media de 8006 ± 7329 leucocitos/mm3 (rango 1100 a 35 600). La sedimentación globular es- tuvo elevada en ocho de los 11 (73 %) pacien- tes en los que se realizó (media, 36 mm/hora). Al ingreso al estudio, la seroaglutinación de Huddleson fue positiva en 16 pacientes (69 %) con títulos de 1:160 a > 1:12 000. En 21/21 niños la PCR para Brucella fue positiva al ingresar al estudio. La prueba Rosa de Bengala fue positiva en todos los pacientes en que se realizó (9/9). Se aisló Brucella sp. en dos de 21 niños. En cuatro pacientes se efectuó mielocultivo y sólo en uno fue aislada Brucella melitensis (cuadro I). En 91 % de los pacientes hubo mejoría clínica a las seis semanas de tratamiento y fra- caso clínico sólo en dos. Un paciente persistió febril durante las 24 semanas de seguimiento y en el otro reapareció la fiebre en la semana 24 (cuadro II). A las seis semanas postrata- miento, en cuatro pacientes (17 %) se documentó      fracaso terapéutico por PCR para Brucella       positiva (pacientes 1, 3, 16 y 23). En nueve niños la prueba serológica de Huddleson continuó      positiva a las seis semanas, aunque con títulos menores (pacientes 7, 12, 13, 15, 16, 17, 20, 22 y 23); en dos, la PCR también fue positiva a las seis semanas. La correlación entre    ambas pruebas fue baja (?= 0.08). A las 12 semanas, los pacientes 1, 3 y 23 (13 %) persistieron con PCR positiva. En el paciente 5 (4.3 %), la PCR fue positiv

Síguenos