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PRODUCCIÓN DE LACASA EXTRACELULAR, REMOCIÓN DE FENOLES Y ...

tecnologÍa quÍmica vol. xxvii, no. 3, 2007 83 producciÓn de lacasa extracelular, remociÓn de fenoles y cafeÍna por pleurotus spp . cultivado en pulpa de cafÉ nora garcía ...

Enviado* el 31/12/2010 18:04
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 83      PRODUCCIÓN DE LACASA EXTRACELULAR, REMOCIÓN DE FENOLES Y CAFEÍNA POR Pleurotus spp . CULTIVADO EN PULPA DE CAFÉ Nora García Oduardo*, Rosa Catalina Bermúdez Savón*, Christopher Augur**, Sevastianos Roussos**, Isabelle Perraud-Gaime** *Centro de Estudio de Biotecnología Industrial (CEBI), **Universidad Paul Cézanne, Marsella, Francia Se muestran los resultados del cultivo de seis cepas de Pleurotus spp . (cinco de P. ostreatus y una de P. sajor-caju ) sobre pulpa de café en un sistema de fermentación sólida. En este trabajo, se discute la capacidad del hongo de pudrición blanca, Pleurotus spp ., para producir enzima lacasa durante su crecimiento sobre pulpa de café, empleando el dispositivo de fermentación sólida aerobia y las columnas de vidrio descritas por Raimbault, a diferentes escalas de fermentación con similar factor gravimétrico de escala: 30 g (pequeña); 150 g (media) y 750 g (grande). Se analiza además, la disminución de los compuestos tóxicos: fenoles totales y cafeína, presentes en la pulpa de café, obteniéndose una relación entre la detoxificación de estos compuestos y la máxima producción de la enzima lacasa. El comportamiento cinético estudiado fue similar en todas las escalas de fermentación, indicando la efectividad del criterio de escala seleccionado. Palabras clave: Pleurotus spp .,  pulpa de café, enzima lacasa, fermentación en estado sólida. The results of the cultivation of six strains of Pleurotus spp. (five P. ostreatus and one P. sajor-caju ) on coffee pulp by solid state fermentation system are presented. In this work the capacity of white- rot fungi, Pleurotus sp ., to produce laccase enzyme during the colonization of coffee pulp was evaluated for solid state fermentation columns described by Raimbault, at different scale-up using similar gravimetric scale factor: 30 g (small); 150 g (medium) and 750 g (large). The lost of toxic components, particularly total phenols and caffeine, was also studied; a relation between detoxification of this compounds and maximum production of laccase enzyme, was observed. The ability to obtain the same results in all the fermentation columns sizes indicates the high potential of the simple scale-up criterion used. Key words: Pleurotus spp. , coffee pulp, laccase enzyme, solid state fermentation. _____________________ Introducción La lacasa (p-difenol:dioxígeno: óxido-reductasa, EC 1.10.3.2), es una de las pocas enzimas que es objeto de investigación desde principios del siglo XIX/1/, es una multicobre azul oxidasa que cataliza la oxidación unielectrónica de orto y para difenoles y aminas aromáticas, por remoción de un electrón y un protón de un grupo hidroxilo para formar un radical libre. Ésta puede, además, catalizar la ruptu- ra alquil-fenil y C ? -C ? de dímeros fenólicos de la lignina y la demetoxilación de muchos compuestos modelos de la lignina. /2, 3/ La enzima lacasa ha sido empleada de forma inmovilizada para remover compuestos xenobióticos de residuales acuosos /4/, en la detoxificación de compuestos fenólicos en vinos /5/, en la obtención de hidrolizados de ligninocelulosa antes de ser usados para la fermentación          alcohólica por S. cerevisiae /6/, y se ha reportado su participación en la decoloración de melazas, colorantes /7/ y efluentes coloreados como la vinaza de destilería y el extracto líquido de la cocción de la pulpa de café. /8/ Los hongos de pudrición blanca poseen un siste- ma multienzimático complejo, del cual la lacasa forma parte, que les permite degradar además de la lignina un gran número de compuestos de estructu- ras disímiles y complejas. Dentro de estos hongos se encuentra Pleurotus spp. , cuyo sistema enzimático ligninolítico se caracteriza por la producción de las enzimas: lacasa, manganeso peroxidasa y veratril alcohol oxidasa, pero no lignina peroxidasa /9/. Pleurotus spp . es muy utilizado en zonas tropicales por sus facilidades para crecer sobre una gran diversidad de subproductos agroindustriales, y por la calidad nutritiva y organoléptica de su cuerpo fructífero.        /10/
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 84 Entre los subproductos agroindustriales más empleados en el cultivo de Pleurotus está la pulpa de café, rica en carbohidratos, proteínas y mine- rales, aunque la presencia de taninos, cafeína y polifenoles limita su utilización y aplicación co- mercial /11/; por lo que se convierte en un considerable        agente contaminante de ríos y zonas aledañas a las despulpadoras de café. Otras alter- nativas de utilización de la pulpa de café son la fermentación sólida y el vermicompost, las cuales permiten el reciclaje de este subproducto al medio ambiente. /10, 12/ La fermentación en estado sólido (FES) ofrece ventajas sobre la convencional fermentación sumer- gida al emplear sustratos que pueden actuar simultáneamente,            como soportes y fuente de nutrientes a los microorganismos que se cultivan en ellos, redu- ciendo considerablemente los costos de producción; estos sustratos son heterogéneos, insolubles en agua y de naturaleza compleja, por lo que es necesario convertirlos en sustratos adecuados para que pue- dan ser utilizados por los microorganismos para la producción de enzimas. /13/ Aunque la FES en columnas de vidrio ha sido muy empleada para los estudios de crecimiento de microorganismos y degradación de compuestos complejos, como los polifenoles, lignina, cafeína en la pulpa de café y otros sustratos, su uso se ha limitado a los de hongos filamentosos /14, 12/, siendo nula la información sobre el cultivo de basidiomicetos a nivel de columnas de FES. El cultivo comercial de Pleurotus spp. sobre pulpa de café a niveles de producción, empleando bolsas plásticas con la finalidad de comercialización de las setas,  está  siendo cada día más difundido y perfeccionado /10,15, 16/, lo que requiere inten- sificar el estudio de los mecanismos utilizados por Pleurotus spp. , durante su crecimiento vegetativo para lograr una más efectiva transformación del sustrato, a través de su complejo enzimático, pudiendo ser también a su vez ésta una fuente de obtención de enzimas lacasas. En el presente trabajo, el objetivo es estudiar la producción de la enzima lacasa por fermentación en estado sólido a diferentes escalas de fermentación,        y su relación con la disminución de la concentración de compuestos tóxicos como los fenoles totales y la cafeína presentes en la pulpa de café, empleando diferentes cepas de  Pleurotus spp. como biodegradadoras de este subproducto. Materiales y métodos Cepas Se estudiaron seis cepas de  Pleurotus spp .: P. ostreatus , CCEBI 3021, CCEBI 3023 y CCEBI 3073; P. ostreatus (var.) Florida, CCEBI 3024 y P. sajor-caju, CCEBI 3027, pertenecientes a la colección de cultivos del Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente, Cuba, y P. ostreatus,  MC 50, procedente de la colección del Colegio de Posgraduados de Pue- bla, México. Éstas se conservaron en agar papa dextrosa a 25 °C. Medios de cultivo Se emplearon tres medios agarizados: agar papa dextrosa (SIGMA); extracto pulpa de café con glucosa y extracto pulpa café sin glucosa /15/ .  Todos los medios se esterilizaron a 121 °C durante 15 min. Inóculo Granos de trigo ( Triticum aestivum L.) (50 % humedad) previamente esterilizados durante 1 h a 121 0C; posteriormente se inocularon con las cepas en estudio y se incubaron a 25 0C durante 10 d. Sustrato Se empleó pulpa de café ( Coffea arábica L. ) seca, molida y tamizada (entre 0,8 y 2 mm), procedente del centro de beneficio húmedo "El Ramón" en el municipio Santiago de Cuba. Fermentación en estado sólido Se trabajó a tres escalas de fermentación, empleando factor gravimétrico de escala igual 5: pequeña (30 g), media (150 g) y grande (750 g)
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 85 (tabla 1). Los fermentadores consisten en colum- nas de vidrio /17/  que contenían la pulpa de café húmeda (67 %), éstos se colocaron sobre los humidificadores y se introdujeron dentro del baño termostatado (figura 1), bajo las siguientes condicio- nes: temperatura: 25±0,5 °C, flujo de aire para cada columna: 2 mL/min/g de sustrato seco y 10 % (peso/peso) de inóculo. Tabla 1 Descripción de las escalas de fermentación Dimensiones (cm) Volumen (mL) Escala de fermentación Altura Diámetro Total De trabajo Carga (g) pequeña 20 2,5 95   65 30 media 30 4,0 350  250 150 grande 20 10,0 1 600 1 600 750 Cada columna funcionó independientemente, permitiendo retirar las mismas para tomar las muestras sin desestabilizar el resto del dispositi- vo. Se llevó la fermentación hasta los 7 d en todas las escalas de fermentación. Tratamiento de las muestras Para las escalas de fermentación pequeña y media se tomaron muestras de sustrato húmedo   de cada columna (duplicado para cada determinación):              a 10 %: determinación de hume- dad y análisis de cafeína, b 20 %: extracción con agua y determinación de la actividad lacasa y c 20 %: liofilización y molido antes de la medición de fenoles totales. Para las escalas pequeña y media se tomaron muestras cada día; para la escala grande sólo se tomaron las muestras inicial y después de 7 d de fermenta- ción. Fig. 1 Dispositivo de fermentación aerobia con columnas de fermentación en estado sólido. 1. Entrada del aire. 2. Baño de agua. 3. Humidificadores. 4. Termostato. 5. Columna de fermentación. 6. Válvulas de control del aire.
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 86 Evaluación cualitativa de la actividad lacasa Se determinó empleando el 2,2'-azino-bis (3 etilbenzotiazolina-6  ácido  sulfónico)   (ABTS) 0,2 mol en tampón fosfato citrato (pH 3,30  0C). /18/ Se añadieron dos gotas sobre el micelio de Pleurotus spp. , una en el centro y otra en el lateral de la placa, el cambio de coloración de la gota a un verde azul intenso cuando transcurren 7-10 d indicó la presen- cia de enzima lacasa. Evaluación cuantitativa de la actividad lacasa Se utilizó el mismo sustrato que en la determinación       anterior,  ABTS /3/. La mezcla de ensayo fue: ABTS 2 mmol/L en tampón citrato de sodio 0,1 mol/L (pH 3, 30 °C). La oxidación del ABTS se siguió a través del incremento de la absorbancia a 420 nm ( ? = 36 000  M-1cm-1). La actividad enzimática se expresó en U/g de sustrato seco, y se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µmol de ABTS oxidado, en 1 min bajo las condiciones especificadas. Evaluación del contenido de fenoles totales y cafeína La concentración de fenoles totales se determinó     por el método de Folin-Ciocalteu /19/, y la cafeína, por cromatografía liquida de alta presión (HPLC), luego de la extracción con agua caliente de las muestras liofilizadas y pulverizadas /20/. Los valores de ambas determinaciones se expre- saron en mg/g de sustrato seco. Resultados y discusión Evaluación cualitativa de la actividad enzimática lacasa Con el fin de seleccionar entre las seis cepas de Pleurotus spp . las mejores productoras de lacasa, se evaluó cualitativamente la actividad enzimática sobre los medios de cultivo agarizados, la coloración es más intensa y aparece con  mayor rapidez cuando se añade la gota de ABTS en el centro de la placa, donde existe el micelio más envejecido (figura 2).                                    A                                                                                           B Fig. 2  Actividad lacasa cualitativa sobre micelio de Pleurotus spp. crecido sobre extracto de pulpa de café con glucosa, lateral (A) y centro (B) Se detectó escasa o nula coloración en el medio extracto pulpa café sin glucosa, lo cual pudiera estar asociado con el pobre crecimiento micelial de las cepas en este medio carente de esta fuente carbonada. En los restantes medios de cultivo la evaluación de la actividad lacasa  fue similar para las seis cepas (tabla 2).
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 87 Tabla 2 Evaluación cualitativa de actividad lacasa extracelular de las cepas de Pleurotus spp. sobre los medios de cultivo a los 10 d de incubación a 25 °C Fermentación sólida a diferentes escalas Se llevó a cabo la fermentación sólida con las seis cepas de Pleurotus spp. sobre pulpa de café a escala pequeña, seleccionándose dos de ellas para el estudio cinético de la producción de la enzima lacasa y de la disminución del contenido de polifenoles y cafeína. Todas las cepas desarro- llaron micelio y mostraron buen crecimiento du- rante los 7 d de fermentación (figura 3). Todas las cepas expresaron actividad lacasa durante los 7 d de fermentación,  siendo máximos    los valores de actividad entre el segundo y el cuarto día de fermentación,  la cepa CCEBI 3023  presentó el mayor valor, 25 U/g, al cuarto día. El comportamiento cinético de las seis cepas fue muy similar, prácticamente todas expresan máxima actividad y luego tienden a decrecer a partir del tercero o cuarto día (figu- ra 4).            Pequeña                                       Media                                           Grande Fig. 3 Columnas FES con micelio de Pleurotus spp. agar papa dextrosa extracto pulpa de café con glucosa extracto pulpa café sin glucosa Cepa centro lateral centro lateral centro lateral CCEBI 3021 xxx xx xx x xx xx CCEBI 3023 xx x xxx xxx xx xx CCEBI 3024 xxx xx xxx xxx - - CCEBI 3027 xxx xx xxx xx - - CCEBI 3073 xxx xx xxx xxx xx xx MC 50 xxx xx xxx xxx xx xx         x  verde azul claro             xx verde azul        xxx verde azul intenso          - no cambio de coloración.
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXVII, No. 3, 2007 88 Fig. 4 Cinética de la actividad enzimática lacasa durante el crecimiento de seis cepas de Pleurotus spp. (CCEBI 3021, CCEBI 3023, CCEBI 3024, CCEBI 3027, CCEBI 3073, MC 50) sobre pulpa de café a escala pequeña de fermentación. La cepa CCEBI 3024 ha sido estudiada para decolorar efluentes coloreados como la vinaza de destilería y el procedente de la pasteurización de la pulpa de café (ELP), reportándose valores de actividad lacasa de 8,53 ± 0,73 U/mL, a los 9 d de cultivo en este último residual. /8/ Conociendo estos antecedentes y los resultados obtenidos en los medios agarizados y en escala pequeña, se escogieron las cepas CCEBI 3023 y 3024 para continuar los estudios a otras escalas. La producción de la enzima lacasa está asociada con la morfogénesis de las cepas de Pleurotus spp., debido a que su nivel se incrementa con el creci-

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