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INFORME Efectos de los tratamientos con Dexametasona y con ...

Facultad de CC. Biológicas Ciro Cabal Ruano Biología Experimental (Molecular y Celular) DNI: 02667863-R Turno 3 (4/12/2008 - 21/01/2009) Laboratorio 3, grupo 10 1 INFORME ...

Enviado* el 31/12/2010 18:12
Facultad de CC. Biológicas Ciro Cabal Ruano Biología Experimental (Molecular y Celular) DNI: 02667863-R Turno 3 (4/12/2008 - 21/01/2009) Laboratorio 3, grupo 10 1 INFORME Efectos de los tratamientos con Dexametasona y con Kanamicina, y sus interacciones, en ratas Wistar ÍNDICE Resumen 1 Introducción 2 Objetivos 3 Materiales y Métodos 4 Diseño experimental, tratamientos y disección 4 Cariotipo 4 Inmunohistología del bazo 5 Inmunodetección de proteínas del bazo y del plasma 5 Microbiota intestinal 6 Análisis Estadístico de Datos 7 Resultados 9 Cariotipo 9 Inmunología 11 Microbiota intestinal 12 Parámetros endocrinos y metabólicos 13 Discusión y Conclusión 15 Discusión del cariotipo 15 Discusión de inmunología 15 Discusión de microbiota intestinal 18 Discusión de parámetros endocrinos y metabólicos 20 Conclusión 24 Bibliografía 25 Resumen: Los tratamientos con antibióticos aminoglucósidos,  como es la kanamicina, y con análogos de hormonas corticoides, como es la dexametasona, son útiles para el tratamiento de algunos pacientes, pero pueden tener también efectos colaterales negativos. Además pueden ser utilizados para el estudio y reconocimiento de la variación de parámetros fisiológicos, celulares y moleculares naturales en modelos animales de experimentación. Utilizando ratas Wistar de experimentación hemos tratado de determinar los efectos que tienen estos fármacos por separado, confirmando que los resultados corroboren experimentos anteriores de otros autores. También se ha estudiado la interacción entre ambos fármacos en caso de un doble tratamiento, observando que en algunos casos pueden producir efectos antagónicos. Se demuestra que existen efectos significativos de la dexametasona sobre el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal. También se han detectado efectos inmunosupresores y metabólicos en las ratas Wistar de este glucocorticoide. Además se observan efectos de la kanamicina sobre la microbiota intestinal y sobre parámetros endocrinos del modelo animal. También se ha detectado una interacción del efecto de cada uno de los fármacos sobre algunos parámetros metabólicos; la kanamicina potencia la involución del peso de las ratas debida a la dexametasona. Finalmente, no se han detectado anomalías cromosómicas para ninguno de los tratamientos.
Informe de Biología Experimental (Molecular y Celular) 2 INTRODUCCIÓN La dexametasona es un glucocorticoide sintético análogo del cortisol, de uso terapéutico. Su potencia es 25 veces superior a la del cortisol, y no presenta actividad mineralocorticoide, a diferencia de la hormona endocrina. La estructura química de la dexametasona es análoga a la del glucocorticoide natural, introduciendo un átomo de flúor en el carbono 9, y un grupo metilo el carbono 16 (figura 1) . 1 Figura 1: Estructura química de la dexametasona. La dexametasona suele ser administrada por vía tópica en humanos. Desde que alcanza el torrente sanguíneo tiene una semivida plasmática de 300 minutos, y la duración de sus efectos en los tejidos es larga; alrededor de 36-54 horas. El átomo de flúor de la dexametasona retrasa su cinética de inactivación y catabolismo respecto al que presenta el cortisol. Se suelen administrar dosis de 0,75 mg a 9 mg.1 Los corticoides son hormonas esteroides y liposolubles, capaces de atravesar la membrana celular por difusión pasiva. Sus receptores constituyen una superfamilia de receptores intracelulares para hormonas esteroides, tiroideas, retinoides y vitamina D. En el caso del cortisol, sus receptores se encuentran libres en el citosol de las células diana. Sólo cuando el cortisol se une y activa a su receptor, éste es capaz de formar dímeros activados y penetrar al núcleo para unirse al ADN modificando la expresión génica. La unión del ligando provoca un cambio conformacional en la proteína receptora; entonces se libera el complejo proteico inhibidor quedando expuesta la región de unión al ADN del receptor. 2 El receptor de cortisol activado puede ser tanto activador como represor de la transcripción de determinados genes. Primero se produce una respuesta primaria, por acción directa del receptor de cortisol activado, que consiste en la síntesis de un grupo de proteínas. Las proteínas de la respuesta primaria, a su vez, desencadenan la respuesta secundaria activando o inhibiendo la expresión de otros genes. Las proteínas cuya expresión es activada o reprimida en la respuesta secundaria son responsables de la respuesta detectable a nivel celular y fisiológico.2 Sólo algunas células concretas presentan receptores para glucocorticoides. Además, los glucocorticoides desencadenan respuestas diferentes en los distintos tipos celulares. Así, por ejemplo, en las células del hígado indican la necesidad de producir glucosa a partir de otras moléculas más pequeñas como son los aminoácidos, mientras que los adipocitos responden ralentizando las mismas rutas metabólicas que son aceleradas en el hígado. 2 El cortisol es una hormona relacionada con el control de múltiples funciones metabólicas e inmunes, secretada por la corteza de las glándulas suprarrenales en mamíferos, o en general en el tejido esteroidogénico de vertebrados. 3 Al igual que todos los glucocorticoides, mineralocorticoides y esteroides sexuales, su biosíntesis utiliza como precursor al colesterol. Su concentración y acción está regulada por el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal vía CRH (hormona liberadora de corticotropinas) y ACTH (hormona adrenocorticotro pa) . 3 La hormona adenohipofisaria ACTH induce la producción de cortisol en las glándulas suprarrenales de mamíferos. El reloj biológico endógeno controla la regulación de corticoides vía CRH (secreción por ciclos). Los niveles son máximos en las primeras horas de la mañana, antes de despertar. Las secreciones se incrementan como respuesta al ayuno y otros tipos de estrés fisiológico. Existen mecanismos de feed-back o retrocontrol negativo sobre la producción de la ACTH y de la CRH, por altas concentraciones de hormonas corticoides. Además, las altas concentraciones de ACTH pueden inhibir la liberación de CRH. 3 A nivel inmunológico se caracteriza por sus efectos inmunosupresores y antiinflamatorios. A nivel metabólico se conocen múltiples efectos, entre los que destacan la movilización de aminoácidos en el músculo, la gluconeogénesis hepática (y el consecuente aumento de la glucemia), y la transferencia de ácidos grasos desde el tejido adiposo al hígado. En general, sus acciones fisiológicas van dirigidas al incremento de la disponibilidad de energía para el músculo y para el sistema nervioso (este último sólo puede utilizar la glucosa como fuente de energía) . 3
Efectos de los tratamientos con Dexametasona y con Kanamicina, y sus interacciones, en ratas Wistar 3 En realidad los glucocorticoides tienen muchas otras acciones, como la estimulación de la secreción gástrica. Además, en algunos vertebrados, como por ejemplo, en muchos peces migradores anádromos o catádromos, como el salmón, el cortisol está implicado en procesos de osmorregulación. En esta especie, los cambios en la actividad del cortisol pueden desencadenar la síntesis o destrucción de sistemas de transporte transmembrana de células osmorreguladoras, así como cambios cualitativos y cuantitativos en las células del cloruro de las branquias.3 La kanamicina es un antibiótico del grupo de los aminoglucósidos, sintetizado de forma natural por bacterias del género Streptomyces. Presenta acción bactericida selectiva contra las bacterias gramnegativas, pero afecta también a bacterias grampositivas e incluso ácido-alcohol resistentes. Suelen ser utilizadas para el tratamiento de infecciones por bacterias aerobias gramnegativas, fundamen- talmente enterobacterias y pseudomonas. Generalmente se aplica por vía parenteral. 4, 1 Como muchos otros aminoglucósidos, la kanamicina contiene un anillo aminociclitol central, unido por enlaces glucosídicos a dos aminoazúcares (figura 2). 1 Figura 2: Estructura química de la kanamicina, sintetizada naturalmente por Streptomyces. Los aminoglucósidos deben ser introducidos en las células por mecanismos de transporte activo en medio aerobio. Pueden unirse a la subunidad pequeña 30-S del ribosoma procarionte e inactivarlo, y causan errores de lectura en el ARN mensajero. Este mecanismo es sólo bacteriostático, por lo que deben existir otros mecanismos implicados. Pueden llegar a resultar tóxicos para los tejidos animales. 4, 1 La eliminación metabólica de estos compuestos no puede llevarse a cabo. Cuando alcanzan el torrente circulatorio. Pueden sin embargo ser excretados por el sistema nefrítico a través de la orina.1 Aunque su absorción es buena cuando se aplica peritonealmente (para un efecto sistémico), es mínima al aplicarse por vía oral, inhalatoria y cutánea (hará su efecto localmente). 1 Existen mecanismos de resistencia contra este grupo de antibióticos. El mecanismo más destacable es la síntesis de enzimas inactivadoras que modifican la estructura química del compuesto.1 Existen estudios que demuestran que los enterococos y otros estreptococos (cocos grampositivos) pueden desarrollar resistencia cruzada para la kanamicina y otros antibióticos, por síntesis de enzimas inactivadoras. 5 Los aminoglucósidos pueden provocar nefrotoxicidad y ototoxicidad. Además, aplicados por vía oral, causan molestias intestinales, e incluso malabsorción en caso de tratamientos crónicos. 1 Objetivos: En nuestro experimento tratamos de cuantificar los efectos de la dexametasona y de la kanamicina en ratas Wistar, a nivel pluridisciplinar. Los métodos y técnicas empleados están particularmente dirigidos, por un lado,  a la realización de un cariotipo para detectar posibles anomalías cromosómicas. También se pretende caracterizar cualitativa y cuantitativamente la microbiota intestinal en el intestino delgado y el intestino grueso. A partir de parámetros fisiológicos generales se valorará el efecto de los fármacos sobre el metabolismo, especialmente el de proteínas,  a través de las tasas de crecimiento e índices organosomáticos, y también a partir de análisis bioquímicos de determinación de la concentración de proteínas en el plasma sanguíneo. Por último, se determinará el estado del sistema inmune y especialmente la actividad de IgG (inmunoglobulina G), a través de la histomorfología e identificación de células IgG + en el bazo, y de la inmunocuantificación de IgG en el bazo y en el plasma. La principal finalidad de este estudio es determinar la acción y la posible interacción entre los tratamientos con ambos compuestos (kanamicina y dexametasona) sobre el cariotipo, el metabolismo, el sistema inmune y la microbiota intestinal del modelo animal utilizado, bajo la hipótesis de que dicha interacción pudiera existir.
Informe de Biología Experimental (Molecular y Celular) 4 MATERIALES Y MÉTODOS Diseño experimental, tratamientos y disección: Para la realización de nuestros análisis se han utilizado veinticuatro ratas Wistar (Rattus norvegicus) . Se ha utilizado esta especie por ser considerada un modelo animal mamífero adecuado para la experimentación. Se han seleccionado ratas macho de dos meses de edad, con el fin de eliminar el posible efecto hormonal del ciclo estral de las hembras que se completa cada cinco días, dado que trabajamos con una hormona esteroide sintética. Todos los individuos han estado en condiciones óptimas bajo control veterinario, a temperatura constante (21 ºC) y con alimento y agua ad libitum. Todas las jaulas han sido mantenidas limpias y ventiladas, pero no en condiciones de esterilidad. El peso inicial de las ratas era aproximadamente de 200 gramos; se han tomado los datos del peso a los cinco y a los diez días de tratamiento. Las ratas han sido divididas en cuatro muestras de seis individuos. Un grupo de ratas control han sido inyectadas con suero, para compensar el estrés sufrido por las ratas sometidas a tratamientos. El resto de animales han sido sometidos a tratamientos subcrónicos de diez días, respectivamente con dexametasona, kanamicina y con doble tratamiento. Un grupo ha sido tratado con dexametasona (1 mg. kg -1 de animal por día) inyectada subcutáneamente, un método que asegura la lenta cinética de absorción del compuesto por el torrente circulatorio, para prolongar el efecto. Un tercer grupo ha recibido un tratamiento con kanamicina A (1,2 g.kg -1 de animal por día) administrada por vía oral a través del agua de bebida. Esta vía es muy adecuada para compuestos químicos de pequeño tamaño o liposolubles, que no puedan ser escindidos por las enzimas digestivas. En este caso el compuesto será absorbido por el torrente circulatorio en muy baja proporción, y se espera una acción local del antibiótico en el sistema digestivo.1 Finamente, el cuarto grupo ha recibido un doble tratamiento con kanamicina y dexametasona administradas por las mismas vías y en las mismas dosis que en los casos anteriores. Las ratas han sido sacrificadas respetando la normativa vigente en el estado español (Ley 32/2007 para el cuidado de los animales, en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio) . El sacrificio ha sido llevado a cabo el día 10 de tratamiento, momento en el que se han obtenido todas las muestras, y conservado para análisis posteriores. El hígado, el timo y las glándulas adrenales han sido pesados para obtener los índices organosomáticos, y posteriormente han sido descartados. Los animales han sido tratados con colchicina para bloquear las células en metafase, y 45 minutos después (tiempo de actuación óptimo de la colchicina) se han extraído las células madre sanguíneas de la médula ósea para la realización de un cariotipo, puesto que presentan una alta tasa de división mitótica. Las células de médula ósea se han sometido a un choque hipotónico en cloruro potásico (0,075 M) a 37 ºC durante 30 minutos. Posteriormente han sido centrifugadas, fijadas en metanol:acético (3:1) y centrifugadas de nuevo tres veces, eliminando el sobrenadante en cada centrifugación y añadiendo nuevo metanol acético. Han sido conservadas en nevera a 4 ºC. El bazo se ha pesado, y luego 0,3 gramos del mismo han sido conservados a -20 ºC para pruebas bioquímicas. El resto del órgano se ha congelado en nitrógeno líquido y conservado a - 80 ºC, introducido en una balsa de Tissue-Tek para la realización de cortes histológicos en criostato. También se ha extraído y centrifugado sangre, para obtener el plasma sanguíneo de los animales, que se ha conservado a -20 ºC. Finalmente se han recogido muestras del intestino delgado (duodeno-yeyuno) y del intestino grueso (heces) que se han conservado a -80 ºC en glicerol (10%) en solución salina, para pruebas microbiológicas. Todo el material contaminado ha sido descartado y debidamente tratado, especialmente el material que entraña riesgos para la salud o riesgos ambientales. Los restos orgánicos no contaminados han sido cedidos para la alimentación de la fauna silvestre. Cariotipo: Se ha sometido a las células de médula ósea en metanol acético a una última centrifugación. Se ha eliminado el sobrenadante, conservándose solo un mililitro de suspensión de células. Las células han sido lanzadas desde 50 cm de altura a portaobjetos, con el fin de hacer estallar los núcleos. Se ha realizado una tinción no diferencial con Giemsa en tampón fosfato
Efectos de los tratamientos con Dexametasona y con Kanamicina, y sus interacciones, en ratas Wistar 5 (pH=6,8) . A continuación las preparaciones han sido fijadas con fuego y montadas con resina Entellán. Los cromosomas de una célula de las cuatro muestras de ratas han sido fotografiados con microscopio óptico de 100 aumentos. Las fotografías digitales han sido procesadas informáticamente, con el objetivo de determinar si alguno de los tratamientos produce lesiones graves en los cromosomas. Las imágenes se han utilizado para tomar medidas de longitud relativa e índice centromérico de los cromosomas de las ratas, para realizar un cariotipo. Además han servido para comprobar la pureza del germoplasma de la cepa de ratas utilizada. Inmunohistología del bazo: Las muestras de bazo, conservadas en balsa de Tissue-Tek, han sido seccionadas en un criostato, confeccionándose cortes de 5 ?m. Se han realizado para cada muestra de ratas dos tipos de tinción. Los cortes han sido fijados en acetona. Posteriormente han sido hidratados y mantenidos en una solución PBS (tampón fosfato salino) . La primera tinción, no diferencial, tiene como objetivo la medición del porcentaje de pulpa blanca para cada tratamiento. Estas muestras han sido teñidas con azul de toluidina (0,5%), que da una coloración más oscura a la pulpa blanca, debido al mayor volumen de los núcleos celulares. Después han sido deshidratadas con alcohol y xileno, y montad

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