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Formas moleculares de gonadotrofina coriónica humana (hCG ...

FORMAS MOLECULARES DE hCG 28 RAEM • 2004 Vol 41 • No. 1 por sistemas basados en la inmunorreactividad de la h o rmona, como inhibición de la aglutinación, fijación de complemento ...

Enviado* el 31/12/2010 18:23
Resumen La hCG, por ser sintetizada por el trofoblasto placentario, desde su descubrimiento ha sido considerada "la hormona del embarazo". Pero, además, es producida por la hipófisis en hombres y mujeres sanos, como así también por tumores de origen no trofoblástico. En fluidos biológicos circula una gran variedad de moléculas relacionadas a la hCG, producto de su síntesis y metabolización. El dosaje de algunas de las formas molecu- lares tiene potencial valor diagnóstico en diferentes patologías. Describimos la producción de hCG en diferentes situaciones clínicas, su heterogeneidad y microhetero- geneidad molecular y su implicancia en la medición de la hormona por diferentes inmunoensayos (IEs). Medimos hCG en muestras de suero correspondientes al primer trimestre de embarazo  normal, con 7 IEs que emplean diferentes juegos de anticuerpos en su diseño y tienen diferente especificidad para reconocer las for- mas moleculares de la hormona. El análisis de concordancia de resultados de cada uno de los métodos re s p e c t o del IQMA (DPC IMMULITE hCG), nos indicó que no todos son intercambiables.  Esto sería atribuible a la hetero- geneidad molecular de la hormona, a la diferente especificidad de los Acs. monoclonales utilizados para el diseño de cada IE y/o a la estandarización de éstos. Es imprescindible entonces, caracterizar cada IE, examinando su capacidad para detectar las diferentes formas moleculares de la hCG que puedan tener implicancia clínica. Abstract The human chorionic gonadotrophyn (hCG), because of being synthesized by placentary trophoblast, has been considered the pregnancy hormone. But it is also produced by hypophisis in healthy men and women, as in nontrophoblastic tumors. A wide variety of  hCG related molecules circulate in biological fluids; they are the product of its synthesis and metabolization: the intact, nicked and clivated molecule, the intact and modi- D i rección Postal: Cecilia Andrea Fenili. Tacuarí 1389 7° B. (1139) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Teléfono 054-11-4300-2900 - e-mail: [email protected] Palabras clave: Gonadotrofina Coriónica Humana, hCG, Medición, Inmunoensayo, Formas moleculares. Key words: Human Chorionic Gonadotropin, hCG, Measurement, Immunoassay, Molecular forms. Recibido: 26-05-03 Revista Argentina de Endocrinología y Metabolismo Copyright © 2004 por la Sociedad Argentina de Endocrinología y Metabolismo Vol 41 • No. 1 R E V I S I Ó N Formas moleculares de gonadotrofina coriónica humana (hCG). Impacto en su medición. Human Chorionic Gonadotropin (hCG) molecular forms: impact on clinical measurements. Saavedra, Mónica Susana 1; Filgueira, Elsa Elena 2; Pessacq, María Teresa 3; Schweizer, J.R.4; Calcagno, María de Luján 5; Fenili, Cecilia Andrea 6. Lab. Centro Gallego de Bs. As. 1, Lab. Hospital Santojanni 2, Lab. Pessacq 3, Lab. Hospital "B. Houssay" 4Cát. de Matemática FFyB.-UBA 5, Lab. Bioanalítica 6. Buenos Aires, Argentina.
FORMAS MOLECULARES DE hCG 28 RAEM •  2004 Vol 41 • No. 1 por sistemas basados en la inmunorreactividad de la h o rmona, como inhibición de la aglutinación, fijación de complemento, radioinmunoensayo, enzi- moinmumoensayo, etc. Desde un comienzo se reportaron discrepancias entre los resultados por diferentes métodos 3,4. El posterior desarrollo de Anticuerpos (Acs.) monoclonales para el diseño de los inmunoensayos (IEs) incrementó la especificidad y sensibilidad pero no mejoró la comparabilidad de resultados 5. El aislamiento de la hCG de fluidos biológicos y fied free subunities, besides the degradation products (molecular heterogeneity). There are also variants with different carbohydrate composition (molecular microheterogeneity). We can find then, a wide variety of circulating       fragments with molecular weight (MW) from 9.5 kD, like beta core, to 40 kD, the MW of the predominant     form in the early weeks of pregnancy, that is the hyperglicosilated hCG. The proportion of the different molecular forms of hCG vary in sera samples of patients in different clinical situations: normal and Ectopic or extrauterine pregnancy, Early pregnancy loss (EPL) or biochemical pregnancy, Gestational Trophoblastic Disease, Down Syndrome screening, Quiescent Trophoblastic Disease (QTD), Unexplained Elevated hCG (UE). These two last pathologies are characterized by persistently low levels of hCG (below 50 mIU/ml), production of hCG with a low grade of glycosilation that is characteristic in the second and third trimesters of pregnancy. Despite being widely used the methods of measuring of hCG in different clinical situations, we must take into account that the dosage of free beta subunit in serum  and/or the beta core fragment in urine are more sensible markers in some types of nontrophoblastic cancers, germinal cells tumors, bladder and ovary cancer, etc. Furthermore, recent development of a test for hyperglicosilated hCG would raise the predictive value of this marker in Down Syndrome screening in second trimester. The immunoassays (IAs) commonly used in the laboratory measuring the hCG have diff e rent abilities to re c o g n i z eall molecular forms. We have compared the results of hCG dosed in sera samples corresponding to patients in the first trimester of pregnancy, obtained with seven different IAs: hCG MAIAclone (IRMA/MAIA, Biodata Diagnostic), hCG Total (ICMA, Chiron Diagnostic), Total Beta (MEIA, Abbott), Nea Tact (IRMA, DSL), HCG Immulite (ICMA, DPC), HCG STAT and HCG+? (ECLIA, Roche Diagnostic). These methods, as they use in its design different sets of antibodies, present different specificity. In normal pregnancy, the intact hCG is the predominant molecular form, but it is possible to detect all the related forms of hCG in smaller proportions. We compared values obtained with each IA with the DPC Immulite method, which would recognize all the molecular forms of hCG of clinical interest. We found significative differences between the different methods, that could be attributed to the molecular heterogeneity and micro h e t e rogeneity of hCG, the diff e rent specificityof antibodies used in each IA, the recognition in a nonequimolecular way of the different molecular forms and the problems in standardization. In short, to some causes inherent to the hormone and the specificity of the IA evaluated, and others inherent to measuring by IA, like its standardization.  The characteristics of the intern a t i o n a l p reparations used as re f e rence and of the partially purified calibrators (containing diff e rent proportions of intact, clivated, or free subunities of hCG) used by the IA manufacturers, make the hCG standardization difficult. From the point of view of diagnosis and follow up of clinical situations where the dosage of hCG is employed, all of the IAs studied are adequate for pregnancy diagnosis because a good correlation is observed among results, but the absence of agreement observed between some of them would indicate that they are not interc h a n g e a b l e ; t h e re f o re, the monitoring of patients must be made with the same method. It is necessary, because of their d i fferent specificities, to characterize each IA, examining its ability to detect the different molecular forms of hCG that may have clinical implications. Introducción Desde el descubrimiento de la Gonadotrofina Coriónica Humana (hCG) en 1920 por Hirose 1, y en 1928 por Aschein y Zondek 2, su medición ha sido la base del diagnóstico de embarazo y se ha empleado también como marcador de tumores trofoblásticos            y no trofoblásticos. Las primeras mediciones de hCG se realizaron con ensayos basados en la determinación de su bioactividad. A partir de 1960, fueron reemplazados
SAAVEDRA, M. S. Y COL. 29 su caracterización molecular permitieron conocer el gran espectro de las formas moleculares asociadas a ella, producto de su síntesis y posterior metabolización,          y de isoformas con diferentes grados de glicosilación, que en parte explicarían las diferen- cias observadas en las mediciones de la hormona (Tabla 1). Hoy sabemos que algunas de las formas circulantes de hCG tienen una potencial relevancia clínica, por ejemplo la subunidad beta libre (hCG? L) como marcador tumoral. El objetivo de esta actualización es, por un lado, describir estructura, metabolismo y producción de hCG en distintas situaciones fisiopatológicas. Por otro lado, queremos plantear las dificultades inherentes a su medición a través de lo reportado en la bibliografía y de nuestra propia experiencia. I. Estructura La gonadotrofina coriónica humana (hCG) es sintetizada por el tejido trofoblástico normal (en el embarazo) y patológico (mola hidatiforme y corio- carcinoma). Su función en el embarazo normal es mantener la esteroideogenésis del cuerpo lúteo hasta el momento en que la placenta alcance el d e s a r rollo adecuado para tomar esta función. Asimismo es producida por algunos tumores (carcinoma     testicular u ovárico de tipo germinal) 6y en bajas concentraciones por hipófisis 7. La hCG es una hormona de PM ~ 36.7 kD (Figura 1) que forma parte de la familia de las glicoproteínas    heterodiméricas hipofisarias: LH, FSH y TSH. Estas hormonas están constituidas por dos sub- unidades: alfa y beta, unidas  por  interacciones de carga y de tipo hidrofóbica. Presentan una gran homología estructural y similar mecanismo de acción por unión a receptores específicos de la familia de receptores con siete dominios transmem- brana, con transmisión de señal Adenilato-Ciclasa- AMPc vía Proteína G estimulatoria. La subunidad alfa, común a todas ellas, está codi- ficada por un solo gen localizado en el cromosoma 6 (p21.1-23) 8. En su estructura contiene 92 aminoá- cidos, 5 puentes disulfuro y 2 sitios de unión "N" para oligosacáridos en los residuos de asparagina 52 y 78 9. La subunidad beta es la que confiere la activi- dad biológica específica a cada una de las hormonas g l i c o p roteicas, presentando una alta homología entre ellas (30-80%). La localización de las cisteínas en la estructura primaria para formar los puentes d i s u l f u ro y la conservación de la secuencia aminoacídica sugieren que las estructuras terciarias de hCG, LH, FSH y TSH son muy similares. La subunidad beta de hCG está codificada por 6 genes (hCG?1, 2, 3, 5, 7 y 8) agrupados en un cluster    simple en tandem y "secuencias invertidas" en el C romosoma 19 (q13.3), al igual que el gen que codi- f i c aa la LH (8). Está compuesta  de 145 aminoácidos,     posee 6 puentes disulfuro, 2 sitios de uniones "N" para oligosacáridos en los residuos asparagina 13 y 30, y 4 sitios de uniones "O" para oligosacáridos    en 4 serinas de la región C-terminal, entre los residuos 121 y 145. Los oligosacáridos presentes en los sitios de uniones " N " son esenciales para el corre c t o plegamiento de la proteína, de su unión al receptor y de su metabolismo 9. (Figura 1). La hCG sólo está presente en algunos primates superiores y en el equino. Probablemente el gen que codifica para la hCG es el resultado, en la evolución, de una duplicación y mutación del gen para LH, que permite la lectura de una secuencia no codificada en su región 3'. Su transcripción origina una secuencia de 30 aminoácidos (posiciones 115- 145) en la región carboxilo terminal denominado "CTP" , ausente en las gonadotrofinas hipofisarias. El ?CTP contiene los azúcares adicionales en uniones "O" , que prolongan la vida media de la hCG circulante 9,10,11 . En la hCG, los oligosacáridos pueden llegar a constituir hasta el 35% de la composición o peso molecular de la hormona y le confieren una gran heterogeneidad estructural (microheterogeneidad). Tabla 1. Causas de las variaciones estructurales de hCG. • Hiper e Hipoglicosilación. • Subunidades libres no combinadas. • Clivaje proteolítico sin pérdida de aminoácidos en la subunidad beta (nicking). • Degradación: 1) Clivado: pérdida del ?CTP. 2) Degradación intensiva: fragmento ?core.
FORMAS MOLECULARES DE hCG 30 RAEM •  2004 Vol 41 • No. 1 La glicosilación no sólo contribuye a la funcionali- dad, sino que también le otorga elasticidad a la molécula y afecta la estabilidad química de sus sub- unidades 9,12. II. Metabolismo La metabolización de la hormona involucra una serie de eventos en diferentes sitios de la molécula. Se inicia con un primer paso de ruptura o corte e n zimático, "nicking", sin pérdida de aminoácidos 13,14,15,16 , que tiene lugar en la subunidad beta ( h C G?), en la región denominada Loop de Keutmann (formado por unión disulfuro entre dos residuos de Cys 38-57), involucrado en la unión de la hormona al receptor y en el reconocimiento antigénico (Figura 2). La ruptura ocurre entre la posición 47-48, y menos frecuentemente en las posi- ciones 44-45 ó 51-52. La enzima responsable del "nicking" es una metaloproteína, la elastasa leucoci- Figura 1. Esquema de la estructura molecular de hCG intacta. Figura 2. Loop de Keutman en subunidad beta de hCG.
SAAVEDRA, M. S. Y COL. 31 taria humana que actúa tanto en tejido trofoblástico como en circulación. El sitio de acción de la enzima es el lugar de mayores interacciones hidrofóbicas y de carga entre las cadenas alfa y beta de la hor- mona, por lo cual esta ruptura genera la aparición de formas moleculares "nicked" (n) y la disociación del dímero 17,18 (Tabla 2). En un segundo paso de metabolización, la "hCG nicked" (hCGn) y la "subunidad ?nicked" (hCG?n) sufren un "clivado" de la molécula con pérdida par- cial o total del fragmento ?CTP (aminoácidos 93- 145); y finalmente se metaboliza en el riñón, dando por resultado el "fragmento beta core" (?cf), el cual es eliminado por la orina 15,17 . En la Figura 3 se muestra el esquema del proceso metabólico de la hCG 19. La primera defensa contra el proceso de metabo- l i z a c i ó nes la glicosilación de la hormona, ya que un mayor porcentaje de carbohidratos (formas hipergli- cosiladas) aumentan su vida media en circulación y d e t e rminan su afinidad por el receptor y su clearence metabólico. Tabla 2. Efectos del "Nicking" • Incrementa la disociación del dímero en alfa libre y en hCG?Ln. • Disminuye el reconocimiento inmunológico debido a cambios en la estructura. • Disminuye la unión al receptor. • Disminuye la actividad esteroideogénica. Figura 3. Formas moleculares y metabolismo de hCG.
FORMAS MOLECULARES DE hCG 32 RAEM •  2004 Vol 41 • No. 1 III. Formas moleculares de hCG Los fluidos biológicos contienen la molécula intacta, nicked y clivada, las subunidades libres intactas y modificadas y los productos de degradación, como así también otras variantes con múltiples alteraciones en la composición de carbo- hidratos como las formas hiperglicosiladas 20. Es decir, que encontraremos una gran variedad de fragmentos circulantes de distinto peso molecular, desde 9,5 kD (?fc) hasta 40 kD (hCG hiperg l i c o s i l ad  a ) . En la Tabla 3 se resumen las formas molecu- lares de hCG y sus características estructurales 19. hCG Hiperglicosilada o Antígeno Tro f o b l á s t i c o Invasivo (ITA) La variante hiperglicosilada de la hCG (H-hCG) es la forma predominante en las 3 semanas posteriore s a la implantación del embrión; representa el 80% de la hCG producida en la primera semana, y es gradual- mente reemplazada por otras isoformas, hasta alcan- zar valores de entre un 25% a 1% después de la ter- cera semana post implantación. La presencia de esta variante en el comienzo del embarazo está rela- cionada al proceso de implantación e invasividad de las células trofoblásticas 21,22 . Una de las primeras evidencias halladas sobre el cambio de las isoformas presentes en el embarazo temprano fue la mayor carga negativa que poseían las moléculas de hCG al inicio de la gestación (determinada por electrofore- Moléculas Abreviatura Estructura relacionadas a hCG hCG intacta PM= 36.5 kD Subunidad alfa libre PM: 14 kD Subunidad beta libre PM: 23 kD HCG hiperglicosilada PM: 40 kD hCG "nicked" PM: 36 kD Subunidad beta libre "nicked" PM: 23 kD hCG con pérdida de "?CTP". PM: 29 kD Fragmento beta core PM: 9.5 kD hCGi hCG?L hCG?L H-hCG hCGn hCG?Ln hCG (- ?CTP) ?fc Compuesta por dos subunidades: alfa y beta. Subunidad alfa: 92 aminoácidos, dos cadenas de oligosacáridos en los sitios de "unión N"  mono o biantenarios Subunidad beta: 145 aa, 6 sitios de unión de hidratos de Carbono (2 de unión "N" y 4 de unión "O").  Alta estabilidad. Máxima actividad biológica. 92 aminoácidos, dos cadenas de oligosacáridos en los sitios de unión "N" mono o biantenarios. Común a LH, FSH y TSH. 145 aminoácidos, 6 sitios de unión de hidratos de Carbono (2 de unión "N" y 4 de unión "O"). 35% de su PM en hidratos de carbono. En la subunidad beta predominan grandes residuos triantenarios de unión "N" y mayor contenido de hexasacáridos en uniones "O". La subunidad alfa contiene fucosa extra en las "uniones N". Forma parcialmente degradada de hCG cuya cadena beta tiene un "corte o nicking" en región del "Loop de Keutmann", sin pérdida de aminoácidos. Forma parcialmente degradada de la subunidad beta libre de hCG, que tiene un "corte o nicking" en región del "Loop de Keutmann", sin pérdida de aminoácidos. Subunidad alfa: 92 aminoácidos. Subunidad beta: aminoácidos 92-122 (el determinante "?CTP" está todo o parcialmente perdido). Pierde uniones "O" de oligosacáridos. También presenta un corte o nicking en región del "Loop de Keutmann", sin pérdida de aminoácidos. Subunidad beta degradada, formado por  2 péptidos (?6-40 y ?55-92) unidos por unión disulfuro. Forma relacionada a hCG mayoritaria en orina. Tabla 3. Características de la formas moleculares de hCG.
SAAVEDRA, M. S. Y COL. 33 sis capilar y electro-isoenfoque) 23. Estas modifica- ciones se correlacionaban con una modulación de la actividad biológica, ya que durante el primer trimestre la hCG posee mayor bioactividad. Se desconocen aún los mecanismos que regulan la glicosilación de la hormona, pero podrían estar relacionados con los niveles de estradiol y progesterona, y sería éste un mecanismo de adaptación feto-madre24. En la enfermedad trofoblástica invasiva se ha descripto la producción de H-hCG o Antígeno Trofoblástico Invasivo por las células del citotro- foblasto. Probablemente, con el empleo de Acs. monoclonales y el desarrollo de equipos comer- ciales 23,25,26 , la medición de H-hCG sería la forma de diferenciar enfermedad trofoblástica gestacional de tipo invasiva de la que no lo es. Podemos inferir, entonces, que los mecanismos de modulación de la bioactividad de la hCG durante la gesta son dos: en el primer trimestre, relacionado al grado de glicosilación, y durante el segundo y ter- cero a la desactivación por "nicking" y posterior metabolización renal de la hormona. IV. Producción de hCG y de moléculas relacionadas La hCG es sintetizada por el tejido trofoblástico normal (en el embarazo) y patológico (mola hidati- forme y coriocarcinoma), por algunos tumores (carcinoma       testicular u ovárico de tipo germinal) y en bajas concentraciones  por hipófisis Las formas moleculares de la hormona varían cuali y/o cuantitativamente en las distintas situa- ciones clínicas, por lo que es importante conocer estas variaciones y tenerlas en cuenta cuando se aplica la medición de hCG al diagnóstico de embarazo, como marcador oncológico o en el screening de Síndrome de Down (Tabla 4). Embarazo Normal La concentración de hCG durante la gestación comienza a aumentar en suero entre los 7 y 11 días después de la ovulación, es decir 21 a 25 días desde la fecha de última menstruación (FUM). Aumenta exponencialmente durante las primeras 5 semanas luego de la implantación, y alcanza el valor máximo en las semanas 8 a 10 desde la FUM. Después de la semana 12, comienza a descender lentamente, alcan- zando niveles casi constantes desde la semana 20 hasta el término de la gesta 19,27 . Existe una gran variabilidad individual en los niveles de hCG durante el embarazo. La forma predominante es la hCG intacta (hCGi) tanto en suero como en orina. Además de la hCGi hay otras variantes de la hormona durante el embarazo: porcentaje bajo y variable de subunidad beta libre (hCG?L) (<1% de los niveles de hCGi), hCGn (10 a 21% de hCGi) y la H-hCG. El ?fc sólo se encuentra en orina y su concentración varía desde una quinta parte de la hCG en el embarazo temprano hasta 5 veces la concentración de hCG a término 28. Luego del parto los valores de hCG comienzan a descender, con una vida media de 24 a 32 hs, y alcanzan valores de no embarazo alrededor del día 21 posparto. Hay que tener en cuenta que luego de un aborto de primer trimestre los

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