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EXPRESIÓN DE CANALES DE POTASIO VOLTAJE DEPENDIENTES EN OVOCIT OS ...

EXPRESIÓN DE CANALES DE POTASIO VOLTAJE DEPENDIENTES EN OVOCIT OS DE Xenopus laevis (AMPHIBIA). Voltage gated potassium channels expressed in Xenopus laevis (AMPHIBIA) oocytes.

Enviado* el 31/12/2010 20:43
EXPRESIÓN DE CANALES DE POTASIO VOLTAJE DEPENDIENTES EN OVOCIT OS DE Xenopus laevis (AMPHIBIA). Voltage gated potassium channels expressed in Xenopus laevis (AMPHIBIA) oocytes. HEDNA CHAVES 1,5 , CARLOS VILLALBA2, LUISA LAGOS3,5, RAFAEL VARGAS4,5, FRANCISCO MARTÍNEZ-WITTINGHAN5, CARLOS CLAVIJO6Y MARCELA CAMACHO5,6 1 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. 2 IVIC, Caracas, Venezuela. 3 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. 4 Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia. 5 Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Bogotá, Colombia. 6 Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Recibido, mayo 21 de 2003. Aceptado, mayo 27 de 2003. RESUMEN La expresión en sistemas heterólogos ha sido una herramienta ampliamente utilizada en los últimos años para el estudio funcional y estructural de proteínas. Para la caracterización           de las propiedades biofísicas de canales, bombas y transportadores en general su expresión en ovocitos de Xenopus laevis , ha sido fundamental. Este estudio reporta la expresión de dos canales de potasio voltaje dependientes, Kv1.1 y Shaker en ovocitos de X. laevis usando un protocolo ajustado a las condiciones de latitud y altitud de Bogotá para la extracción, aislamiento, cultivo y microinyección  de éstas células. Palabras clave: ovocito, Xenopus laevis , voltaje clamp, Kv1.1 , Shaker , expresión heteróloga. ABSTRACT Heterologous expression has been an important tool for structural and functional characterization of proteins. The study of biophysical properties of ion channels, pumps and transporters has been possible thanks to their expression in Xenopus laevis oocytes. Here we report the expression of two voltage gated channels, Kv1.1 and Shaker , in X. laevis oocytes using a method for oocyte extraction, isolation, culture,      and microinjection adapted to the latitude and altitude conditions of Bogotá, Colombia. Key words: oocyte, Xenopus laevis , voltage clamp, Kv1.1 , Shaker , heterologous expression. Acta Biológica Colombiana, Vol. 8 No. 1,  2003   59
INTRODUCCIÓN Los canales iónicos dependientes de voltaje, son proteínas integrales de membrana a través de las cuales se da el transporte selectivo de iones en respuesta a cambios en el voltaje transmembrana. La identificación y caracterización de canales iónicos en diferentes sistemas celulares es una herramienta experimental ampliamente utilizada en estudios de neurobiología molecular. La capacidad de los ovocitos de la rana sudafricana Xenopus laevis para traducir eficientemente la información genética inyectada en su citoplasma (Gurdon et al. , 1971) y de ensamblar e insertar canales iónicos en su membrana para generar respuestas electrofisiológicas, ha hecho de estas células un modelo aceptado para tal fin (Soreq y Seidman, 1992). Esta técnica de expresión permite la caracterización de moléculas de difícil estudio en tejidos intac- tos, ya que éstas son expresadas por el ovocito con la actividad biológica característica     de la molécula nativa (Sumikawa et al. , 1984; Leonard et al. , 1987; Périer et al. , 1992). Hasta donde los autores conocen, todos los estudios realizados usando este modelo se han llevado a cabo a una altitud inferior a 1.320 msnm (promedio de 210 ±291 msnm, n = 42) y al norte del trópico de Cáncer. En nuestra experiencia la estandarización           de las condiciones para la aclimatación y producción de ovocitos de X. laevis fue determinante antes de poder usar este modelo para la caracterización de canales iónicos. De cuatro lot es de X. laevis importados, uno no sobrevivió al proceso de aclimatación a su llegada y la producción y viabilidad de ovocitos en las restante, fue inferior a lo reportado en la literatura. En este trabajo se presentan las condicio- nes experimentales con las que se logró la estandarización de estos procesos y la expresión de canales de potasio voltaje dependientes en ovocitos de X. laevis en las condiciones ambientales particulares de Bogotá. MATERIALES Y MÉTODOS EXTRACCIÓNDEOVOCITOS Hembras adult as de la especie Xenopus laevis laevis (XENOPUS I, Dexter, Michigan) se mantuvieron en acuarios con agua declorinada a temperatura ambiente (14-18ºC) y se aliment aron semanalmente con hígado bovino. Para la extracción de ovocitos, las ranas fueron anestesiadas con MS-222 (ácido 3-amino benzoico etil éster) al 0.23% (Sigma Cat No A5040) a 4ºC por 10-15 minutos y sometidas a laparotomía. El abor- daje abdominal se realizó a través de una incisión paralela al pliegue inguinal de aproximadamente 1 cm. Se extrajeron 2 ml de lóbulos de ovocitos. Después se suturó por planos y la rana se mantuvo aislada por un período de 24 horas hasta su recuperación       de manera óptima (Goldin 1992). CULTIVODEOVOCIT OS Los lóbulos de ovocitos fueron lavados con solución de Barth sin calcio (Tabla 1) y sometidos a separación mecánica con pinzas y química con una solución de protea- sas compuesta por colagenasa tipo IA (Sigma Cat No C-9891) 1 mg/ml y tripsina (Sigma Cat No T-7418) 180 µg/ml, en solución de Barth sin calcio con agitación a 70 rpm, a 22ºC. El tiempo de digestión se evaluó cualitativamente y se prolongó hasta 60 60 Artículo - Expresión de canales de potasio voltaje dependientes en ovocitos de Xenopus laevis (Amphibia). Chávez, et al .
Acta Biológica Colombiana, Vol. 8 No. 1,  2003   61 obtener 50% de los ovocitos aislados. Para finalizar el proceso, los ovocitos se lavaron cinco veces con solución de Barth sin calcio y se dispersaron en una caja de Petri para su selección. Se eligieron ovocitos intactos en estadio V o VI. Aproximadamente 50 ovocitos por unidad experimental se incubaron en solución de Barth a 18ºC. Medio de cultivo Composición ND96 NFR Barth Barth T Barth S NaCl 96.0 115.0 88.00 88.00 88.00 KCl 2.00 2.5 1.00 1.00 1.00 CaCl 2 .2H 2 O 1.80 1.8 0.41 0.41 0.41 NaHCO 3 - - 2.40 2.40 2.40 MgCl2.6H2O 1.00 - - - - MgSO 4 .7H 2 O - - 0.82 0.82 0.82 Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O - - 0.33 0.33 0.33 Hepes 5.00 10.00 20.00 - 20.00 Tris - - 7.50 - Suero fetal bovino (%) - - - - 5.00 pH 7.5 7.2 7.5 7.5 7.5 Tabla 1.  Composición de las soluciones utilizadas. Todas las concentraciones de sales están expre- sadas en mM. INYECCIÓNDEOVOCITOS Usando una micropipeta de inyección (Drummond Scientific Company) con micropipet      as de vidrio ( Vertical pipette puller , David Kopf Instruments; capilares: Custom Glass, Drummond Scientific Company), se inyectaron 50 nl/ovocito de cRNA a una concentración de 0.062 µg/µl. Los ovocitos fueron separados en tres grupos experimentales así: un control sin inyección, un control negativo inyectado con agua HPLC y un control positivo inyectado con cRNA del canal de potasio Kv1.1 (40µg/µl) o Shaker (20µg/µl) cuyas características son ampliamente conocidas (donados por el Dr. Walter Stuhmer,  Institut Max Planck, Gottingen, Alemania). Luego de la inyección los ovocitos se cultivaron en solución de Barth a 18ºC durante 96 horas. La solución de cultivo se cambió diariamente. REGISTROELECTROFISIOLÓGICODEOVOCITOS Para los registros electrofisiológicos los ovocitos se bañaron en solución de Barth sin antibiótico en una cámara de plástico y se visualizaron con un estéreomicroscopio. Las corrientes totales fueron obtenidas usando la técnica de electrofisiología de voltage clamp con dos electrodos usando un amplificador (TEV 200, Dagan Corporation). Las pipetas de registro fueron hechas con capilares para hematocrito, con una solución de KCl 2 M y con resistencias de 0.5-1.0 Mµ. Luego de ubicar los dos electrodos se midió en el modo de corriente el valor del potencial al cual el flujo neto de cargas fue igual a cero  y al que se denominó potencial de reposo (V m ); Posteriormente se registró    la célula en  la modalidad de voltaje. Se generaron pulsos de voltaje desde un
62 potencial sostenido de -80 mV. Las corrientes fueron filtradas a 1 kHz y digitalizadas a 200 µs/punto con una interfase análogo-digital (DigiData 1200 Interface, Axon Instruments, Foster City, CA). La adquisición y análisis de datos se realizó con los pro- gramas PCLAMP6 (Axon Instruments, Foster City, CA) y Origin 7 (Microcal). Los datos obtenidos se analizaron utilizando la prueba de ANDEVA. Valores de p < 0.05 fueron considerados significativos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN EXTRACCIÓNYCULTIVODEOVOCITOS Con el procedimiento descrito en la metodología, no se lograron las condiciones necesarias para garantizar que los ovocitos aislados y cultivados tuvieran una super- vivencia superior a 90% a las 96h. Por lo tanto algunos pasos fueron modificados para cumplir este objetivo. Inicialmente Xenopus fueron expuestas al anestésico a 4ºC por un período de 30 minutos, tiempo en el cual se logró una buena anestesia. Se realizó laparotomía y se extrajeron aproximadamente 2 ml de lóbulos ováricos, que fueron sometidos a separación mecánica y enzimática. Los siguientes tratamientos con proteasas fueron probados: 1.  Colagenasa 0.5 mg/ml + tripsina 90 µg/ml por 90 minutos 2. Colagenasa 0.5 mg/ml + tripsina 90 µg/ml por 120 minutos 3. Colagenasa 1 mg/ml + tripsina 180 µg/ml por 90 minutos 4. Colagenasa 1 mg/ml + tripsina 180 µg/ml por 120 minutos 5. Colagenasa 1.5 mg/ml por 45 minutos Los ovocitos fueron expuestos a estos tratamientos en solución de Barth sin calcio a 22ºC con una agitación de 120 rpm. El cultivo fue realizado en solución de Barth + penicilina estreptomicina (100U/ml:100 µg/ml) a 20ºC en la oscuridad. Los ovocitos fueron observados a las 24, 48, 72 y 96 horas después del tratamiento para calcular su supervivencia y calidad. El porcentaje de supervivencia fue calculado día a día de manera independiente, incluyendo únicamente ovocitos sin alteraciones morfológicas. La supervivencia de los ovocitos tratados con colagenasa y tripsina a diferentes con- centraciones y tiempos de exposición fue igual o menor a 80% a las 96 horas (Tabla 2). Se encontraron valores similares de supervivencia con un tratamiento simplificando de colagenasa 1.5 mg/ml por 45 minutos. Este tratamiento enzimático fue escogido para determinar el impacto del medio de cultivo sobre la viabilidad de los ovocitos. Para esto se usaron cinco soluciones diferentes: ND96, NFR, Barth, Barth con suero y Barth con Tris. Todos los grupos de ovocitos fueron seguidos durante 24, 48, 72 y 96 horas. Los valores de supervivencia con la solución ND96 fueron mayores (93%) que los obtenidos con las otras soluciones (Tabla 2) con un riesgo menor de contaminación.          Inclusión de 0.6% de ovoalbumina (Sigma) en la solución de lavado para detener el efecto de la colagenasa mejoró la supervivencia a 95%. La acción de la albúmina     puede estar relacionada con la propiedad de secuestrar moléculas hidrofóbicas, además de servir de blanco para las proteasas, lo que podría estar ejerciendo una acción protectora sobre los ovocitos. 62 Artículo - Expresión de canales de potasio voltaje dependientes en ovocitos de Xenopus laevis (Amphibia). Chávez, et al .
Acta Biológica Colombiana, Vol. 8 No. 1,  2003   63 Tratamiento* Tiempo de supervivencia 1 2 3 4 5 24 horas 96 100 96 100 98 48 horas 100 100 93 96 86 72 horas 72 53 51 64 80 96 horas 80 37 50 0 80 Tabla 2. Impacto del tratamiento enzimático en la supervivencia de ovocitos. (*) Tratamiento como aparece en la sección extracción y cultivo de ovocitos. INYECCIÓNYREGISTRODEOVOCITOS El método de inyección inicialmente propuesto aseguraba la cuantificación del volumen a inyectar, pero la supervivencia de los ovocitos fue pobre. Esta baja eficiencia era resul- tado del daño mecánico generado por el giro de la micropipeta durante la inyección. El método alterno, escogido para evitar el daño mecánico a los ovocitos, fue inyectar el ARNm por presión. El sistema de inyección por presión consistió de una micropipeta  de inyección hecha de capilares de borosilicato (Hilgenberg, Cat No. 14 080 13) conectada a una manguera de 50 cm de longitud y a una jeringa de 10 cm3. Con la micropipeta fija a un micromanipulador se inyectaron los ovocitos (Stühmer, comunicación personal).      Con este método se inyectaron aproximadamente 100 nl de cRNA de los canales a expresar obteniéndose una supervivencia satisfactoria y buen porcentaje de expresión (9 de cada 10 ovocitos). Todos los grupos de ovocitos fueron registrados con el sistema electrofisiológico Voltage clamp con dos electrodos (Stühmer 1992). Figura 1.  Impacto de la inyección en las corrientes basales de ovocitos de X. laevis . A. Registro de las corrientes de base de un ovocito no inyectado. B. Registro de las corrientes de base de un ovocito inyectado con agua. C. Curvas I-V de los registros mostrados en A (círculos) y en B (cuadros). Inicialmente se midieron los potenciales de reposo de los ovocitos en modo de corriente. El potencial de reposo (Vm), una medida de la permeabilidad de la membrana, fue de -27 ±3.9 (n = 17) y -27.3 ±5.3 mV (n = 13) para ovocitos no inyectados e inyectados con agua, respectivamente. El Vm no fue diferente entre estos dos grupos (p = 0.24) y estos valores fueron similares a los reportados en la literatura. Estos resultados de Vm indican que la permeabilidad basal del ovocito no se altera por la inyección. Los ovo- citos inyectados con cARN de Kv1.1 tuvieron un Vm de -51.7 ±6.7 mV (n = 9) y este
valor fue significativamente diferente del control de inyección (p = 0.0001). Esta diferen- cia fue el resultado de la actividad del canal expresado y coincide con la evidencia en- contrada por otros autores. Una vez medido el Vm, los demás registros se hicieron en el modo de voltaje. Las corrientes de los ovocitos no inyectados (255.0 ±53.4 nA) no fueron significativamente diferentes (p = 0.24) de los controles de inyección (216.2 ± 71.0 nA, Fig. 1), lo que indica que ni el proceso de inyección ni el volumen inyectado afectan las corrientes endógenas del ovocito. En contraste pulsos de voltaje despolari- zantes generan corrientes de salida en ovocitos inyectados con ARNm de Kv1.1 y Shaker . Kv1.1 es un canal cuya amplitud de corriente aumenta con potenciales despolarizantes y su activación es voltaje dependiente (Figs. 2A y B). Figura 2. Expresión de canales KV1.1 en ovocitos de X. laevis . A.  Corrientes a las 48 horas de expresión de un ovocito inyectado con ARNm del canal de potasio KV1.1 . Pulsos desde -100 a 150 mV, (incre- mento 20 mV). Vh = -80mV. B. Curva I-V- para A, con ajuste y cálculo de conductancia. C. Experi- mentos de dos pulsos. Vh = -80 mV. Los pulsos de prueba fueron de 50 mV y el tiempo interpulsos se incrementó en 3 ms para cada trazo. La amplitud de interpulso fue -120 mV. fs = 40 kHz, fc = 5kHz. D.  Corrientes de un ovocito inyectado con ARNm de KV1.1 antes y luego de la aplicación de 5mM 4 aminopiridina en el baño. Para verificar de manera cualitativa los canales expresados, se ensayó un protocolo de dos pulsos en donde un pulso despolarizante previo, genera una disminución en el tiempo de activación de la corriente. Este fenómeno se debe a que los canales como Kv1.1 y Shaker presentan múltiples estados cerrados (no conductores), lo que tiene como consecuencia que, ante una despolarización, los estados cerrados deban ser superados previa apertura del canal. El retorno a un potencial hiperpolarizante genera 64 64 Artículo - Expresión de canales de potasio voltaje dependientes en ovocitos de Xenopus laevis (Amphibia). Chávez, et al .
el cierre del canal y la secuencia de estados cerrados es recorrida en sentido contra- rio. Si un segundo pulso despolarizante es aplicado rápidamente, los canales estarán transitando entre los diferentes estados cerrados previos a la apertura del canal, el número de estados cerrados a pasar será menor, y se abrirán más rápido como se ob- serva en la figura 2C. Para complementar estos hallazgos, este canal fue sometido a la acción de 4-amino piridina (4AP), un bloqueador de canales de potasio. Luego de un minuto de la adición de 5 mM 4AP, la corriente de potasio disminuye 85% (Fig. 2D) y con el lavado del inhibidor la corriente se recupera hasta un 50% del valor inicial (datos no incluidos). Por su parte, Shaker es un canal de potasio voltaje dependiente que se inactiva rápidamente. En la figura 3 se muestran los registros de corriente a diferentes potenciales. Como se puede observar, a medida que el potencial trans- membrana es más despolarizado se incrementa tanto la velocidad de activación de la corriente como la magnitud de la misma (Fig. 3A). El incremento de la corriente es debido al incremento de la conductancia de la membrana (Fig. 3B) cuya curva IV se ajusta a una función de Boltzman modificada. Para estos registros la conductancia máxima fue 793 ±22 nS. Figura 3. Expresión de canales Shaker en ovocitos de X. laevis . A. Corrientes a las 48 horas de expresión de un ovocito inyectado con cRNA del canal de potasio Shaker . Vh= -80mV. Pulsos desde -120 a 60 mV(incremento 15 mV). Frecuencia de muestreo (fs)=50 kHz. Frecuencia de filtrado (fc)= 10 kHz. B. Curva IV de las corrientes de ovocitos inyectados con ARNm de Shaker. La línea corresponde al ajuste Vh = -80 mV. C. Curvas de recuperación de la actividad versus duración del interpulso. Experimentos de dos pulsos. Vh = -80 mV. Los pulsos de prueba fueron de 50 mV y el tiempo inter- pulsos se incrementó en 15 ms para cada trazo. La amplitud de interpulso fue (_) -60 mV, (O) -120 mV y (_) -150 mV. fs = 10 kHz, fc = 2 kHz. Para verificar, de manera cualitativa, la calidad de los canales expresados, un pro- tocolo de cambios de potencial (protocolo de pulsos) de dos pulsos fue utilizado. A partir de un potencial de mantenimiento (Vh), típicamente a -80 mV, se da un primer pulso de potencial a 50 mV, se retorna a un potencial hiperpolarizante (por debajo del potencial de reposo del ovocito) por un tiempo variable, y finalmente se da el segundo pulso de potencial a 50 mV. Este protocolo permite ensayar la recuperación Acta Biológica Colombiana, Vol. 8 No. 1,  2003   65
de la corriente una vez ocurrida la inactivación. En la figura 3C se muestran trece registros con interpulsos de -120 mV y duración desde 0 a 180 ms (incremento 15 ms). Como se puede observar, a medida que aumenta el tiempo de duración del intervalo de tiempo, mayor es la recuperación de la actividad de los canales. El primer pulso tiene una duración de 80 ms que es 20 veces el tiempo medio de la inactivación (4.06 ±0.025 ms, a 50 mV, dato obtenido por ajuste a una exponencial). Usando este criterio, se asume que la corriente esta completamente inactivada al final del pulso. Estos experimentos se repitieron para otras amplitudes del interpulso y se encontró que la actividad se recuperaba más rápidamente si el interpulso era más hiperpolari- zado. Para un interpulso de -120 mV de amplitud, el tiempo medio de recuperación de la actividad fue 34.74 ±1.45 ms, mientras que para interpulsos de -150 y 60 mV, los tiempos medios de recuperación fueron 30.85 ±1.72 ms y 90.86 ±3.136 ms, respectivamente (fig. 3D). Los resultados presentados muestran que los canales Kv1.1 y Shaker fueron expresados satisfactoriamente en ovocitos de Xenopus laevis mostrando las propiedades funcionales típicas para estas moléculas. Para esto se requirió de modificaciones en los procedimientos para la extracción, cultivo y microinyección de ovocitos de Xenopus laevis en las condiciones de latitud y altitud de Bogotá. A la altura de Bogotá la presión de oxígeno es menor que a nivel del mar. En otros anfibios (Hou y Huang 1999), se ha reportado disminución en el consumo de oxígeno, ventilación pulmonar, frecuencia cardiaca, volumen corporal, número de eritrocitos y hemato- crito al ser expuestos a hipoxia. Estos cambios pueden asociarse además a alteracio- nes en la espermatogénesis como ha sido descrito para Bufo melanostictus (Biswas et al ., 1985). En este estudio no se evaluaron estas variables pero sugerimos que alteracio- nes similar es en ovocitos de X. laevis pueden explicar la baja calidad y las dificultades para mantener y registrar estas células. Sin embargo, nuestros resultados muestran que es posible aislar, cultivar y expresar canales iónicos en forma confiable en ovo- citos de X. laevis a 2.650 m.s.n.m. AGRADECIMIENT OS Colciencias, proyecto: 2228-05-10325, Programa de Ciencias Básicas. Banco de la República, proyecto: Estudios de la permeabilidad de la membrana del protozoario Leishmania amazonensis. Convenio Andrés Bello, apoyo recibido por Carlos Villalba. Lewis A. Tyler Trustees' Fund Award, LASPAU: Academic and Professional Programs for the Americas, Cambridge, MA, USA, apoyo logrado por Francisco Martínez- Wittinghan. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física BIBLIOGRAFÍA BIS WAS H. M., BORAL M. C., GHOSH A.  K. 1985. Effect of Hypobaric Hypoxia on Spermatogenesis, Leyding Cells and Delta 5-3 Beta-Hydoxysteroid Dehydrogenase       Activity in Toad. Indian J. Physiol Pharmacol 29 (3): 139-145. GOLDIN, A.  1992. Maintenance of Xenopus laevis and Oocyte Injection. En B. Rudy &

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