Artículo sobre ...

Evaluación del método de difusión en disco de 30 µg de ...

23 213 Rev Esp Quimioter 2008;21(4):213-216 Podemos concluir que el método de difusión en disco de cefoxitina de 30 µg es eficiente para la detección de re-sistencia a meticilina y ...

Enviado* el 31/12/2010 18:06
23 213 Rev Esp Quimioter 2008;21(4):213-216 Podemos concluir que el método de difusión en disco de cefoxitina de 30 µg es eficiente para la detección de re- sistencia a meticilina y permite una clara definición de aquellos aislados de S. aureus, incluidos aquelloscon características           atípicas de resistencia. Palabras clave: Staphylococcus aureus. Cefoxitina. Resistencia a meticilina. Rev Esp Quimioter 2008;21(4):213-216 Evaluation of the cefoxitin 30 µg disk diffusion method for detection of methicillin-resistance in selected Staphylococcus aureus isolates Oxacillin tests may fail to detect some methicillin- resistant S. aureus populations. The objective of this study is to evaluate the discriminative capacity of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) disk diffusion method with a cefoxitin 30 µg disk on S. aureus isolates with unusual phenotypic characteristics of antimicrobial resistance. We studied 53 clinical S. aureus isolates. The antimicrobial          susceptibility of all isolates was routinely studied by the VITEK 2 System (bioMérieux). Methicillin resistance was also studied by CLSI oxacillin method and confirmed by a previously described multiplex polymerase       chain reaction (PCR) method which permits S. aureus identification and simultaneous detection of methicillin resistance. MecA positive isolates presenting a diffuse growth within the zone of inhibition when exposed to oxacillin were considered heteroresistant; mecA negative,      oxacillin intermediate or resistant isolates were considered        borderline. All the isolates were tested with a ce- foxitin 30 µg disk, according to the CLSI guidelines (susceptibility: >22 mm; resistance: <21 mm). Control strains for all assays included MRSA ATCC 43300 and MSSA ATCC 25923. The isolates formed four groups. Group I: 20 multiresistant, oxacillin susceptible and mecA negative isolates; group II: 16 resistant or with intermediate           oxacillin susceptibility and mecA negative Los tests de oxacilina habituales pueden fallar en la detección        de ciertos casos de Staphylococcus aureus resisten- te a meticilina. El objetivo del presente trabajo es evaluar la capacidad del método de difusión en disco de cefoxitina (30 µg) para detectar la resistencia a meticilina en aislados de S. aureus con características atípicas de resistencia. Se estudiaron 53 aislados de S. aureus . La sensibilidad de los mismos se estudió mediante el sistema Vitek, y los tests de oxacilina y de cefoxitina mediante difusión en discos    (Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI] 2007); la resistencia a oxacilina se confirmó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple previa- mente descrita que permite la identificación de S. aureus y la detección simultánea de resistencia a meticilina. Los ais- lados mecA positivos que presentaban crecimiento en la zo- na de inhibición al exponerlos a oxacilina se consideraron heterorresistent es; los que eran mecA negativos pero con sensibilidad intermedia o resistencia a oxacilina se conside- raron límite (borderline). Todos los aislados se ensayaron frente al disco de 30 µg de cefoxitina según normas CLSI (sensibilidad: >22 mm; resistencia: <21 mm). Las cepas de control para todos los ensayos incluyeron S. aureus resis- tente a meticilina ATCC 43300 y S. aureus sensible a metici- lina ATCC 25923. Los aislados formaron cuatro grupos. Gru- po I: 20 aislados multirresistentes, sensibles a oxacilina y mecA negativos; grupo II: 16 aislados con resistencia o sen- sibilidad intermedia a oxacilina y mecA negativos; grupo III: 11 aislados heterorresistentes y mecA positivos; grupo IV: seis aislados mecA positivos con perfiles atípicos de resis- tencia (penicilina y oxacilina; ciprofloxacino y eritromicina). Treinta y cinco aislados mecA negativos incluidos en los grupos I y II mostraron zonas de inhibición >22 mm; un ais- lado del grupo II mostró un halo de 20 mm. Los 17 aislados mecA positivos de los grupos III y IV mostraron resistencia frente al disco de cefoxitina. Originales Evaluación del método de difusión en disco de 30 µg de cefoxitina en la detección de resistencia a meticilina en aislamientos seleccionados de Staphylococcus aureus 1 Sección de Microbiología 2 Unidad de Investigación N. Batista Díaz1 I. Gutiérrez González1 M. Lara Pérez1 F. Laich2 S. Méndez Álvarez2 Correspondencia: Magdalena Lara Pérez Hospital Universitario Ntra. Sra. de la Candelaria Ctra. del Rosario s/n 38010 Santa Cruz de Tenerife Correo electrónico: laramagda@yahoo. es Hospital Universitario  Nuestra Señora de la Candelaria Santa Cruz de Tenerife
isolates; group III: 11 heteroresistant and mecA positive isolates; group IV: six mecA positive isolates with atypical resistance profiles (penicillin and oxacillin, or ciprofloxa- cinand erythromycin resistance). Thirty-five mecA negative isolates included in groups I and II showed inhibition zones >22 mm; one isolate from group II showed 20 mm. The 17 mecA positive isolates from groups III and IV showed resistance to cefoxitin disk. The 30 µg cefoxitin disk diffusion method is proposed as an efficient method for the detection of methicillin resistance and permits a clear determination set S. aureus isolates, even those with atypical antimicrobial characteristics. Key words: Staphylococcus aureus. Cefoxitin. Methicillin-resistance. INTRODUCCIÓN El estudio de la resistencia a meticilina en aislados de S. aureus ha supuesto un desafío para los laboratorios de Microbiología:             a la necesidad del control en la diseminación de estos aislamientos se ha unido en numerosas ocasiones la dificultad de determinar con seguridadsi un determinado aislado era realmente poseedor del gen mecA , determinante de la resistencia a todos los betalactámicos, lo que obligaba a utilizar unas condiciones especiales al realizar el estudio de sensibilidad a oxacilina y/o al empleo de medios alternativos de diagnóstico1; en los últimos años se han desarrollado y es- tudiado algunos de estos métodos de detección más o menos sofisticados o costosos2. La detección del gen mecA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es hoy el método de referencia, aunque no de aplicación sistemática. En el año 2001, Mougeot et al.3propusieron el uso de un disco de 30 µg de cefoxitina, utilizando el método de difusión,        para determinar la resistencia a meticilina. Desde entonces, diversos estudios han ensayado el empleo del disco   de cefoxitina con dicho fin, hallando todos ellos que se trata de una opción sencilla y económica 2,4-8 . El objetivo de nuestro estudio es determinar la utilidad del uso del disco de 30 µg de cefoxitina en el estudio de la resistencia a meticilina en aislamientos clínicos de S. aureus , previamente seleccionados según determinados caracteres fenotípicos de resistencia. MATERIAL Y MÉTODOS Aislamientos bacterianos Estudiamos 53 aislados clínicos de S. aureus obtenidos en el Hospital Universitario N. S.ª de la Candelaria de Santa Cruz de Tenerife. Los aislados se mantuvieron almacenados a -80 ºC hasta su estudio y sólo se estudió un aislado por paciente. S. aureus se identificó mediante prueba de la cata- lasa, tinción de Gram, fermentación en medio Chapman (MSA2; bioMérieux), por el test de coagulación en tubo (Coagulase plasme rabbit with EDTA; BD BBL™), y la producción de termo- nucleasa en placa (DNASA AGAR; bioMérieux). Se incluyeron como cepas de control de S. aureus : ATCC 25923 (sensible a meticilina) y ATCC 43300 (heterorresistente). Análisis del gen mecA. Reacción en cadena de la polimerasa múltiple Se aplicó un protocolo de PCR que permite la detección del gen mecA y la identificación simultánea de los aislados de S. aureus a nivel de especie. Tras la PCR, los fragmentos amplificados fueron analizados mediante electroforesis de agarosa (1%)9. Métodos de estudio de la sensibilidad Test de difusión en discos de oxacilina y cefoxitina El test de difusión en disco (DD) se llevó a cabo prepa- rando un inóculo ajustado al 0,5 de McFarland y extendiéndolo   sobre placa de agar Muller Hinton (bioMérieux). Se utiliza- ron discos de oxacilina de 1 µg y discos de cefoxitina de 30 µg (BD BBL™ Sensi-Disc). Se aplicaron las normas CLSI 200710. Vitek 2 Los testsde sensibilidad con el sistema Vitek 2 (bioMérieux)       se llevaron a cabo según las instrucciones del fabrican- te, empleando las tarjetas AST-P523 y AST-P536 (rango de concentración mínima inhibitoria [CMI] de oxacilina: 0,25-4 µg/ml). Para la lectura de resultados se aplicaron los puntos de corte propuestos para oxacilina en S. aureus por CLSI 2007. Clasificación de los aislados de Staphylococcus aureus Los aislamientos se clasificaron en 4 grupos, según las lecturas obtenidas mediante el sistema Vitek 2 y en el test DD de oxacilina, tras aplicar los criterios que establecen las normas CLSI 2007, y en función además de la presencia o ausencia del gen mecA . Grupo I Formado por 20 aislamientos que mostraron un perfil de multirresistencia y sensibilidad a oxacilina tras su estudio en el sistema Vitek 2, eran sensibles a oxacilina en el test DD, y eran mecA negativos. Evaluación del método de difusión en disco de 30 µg de cefoxitina en la detección de resistencia a meticilina en aislamientos seleccionados de Staphylococcus aureus N. Batista, et al. 214 24 Rev Esp Quimioter 2008;21(4):213-216
Tabla 1 Características de resistencia a cefoxitina, oxacilina y otros antimicrobianos en aislados seleccionados de Staphylococcus aureus Resistencias a antibióticos Cefoxitina (30 µg) Oxacilina ?g no betalactámicos mecA Grupos Características n Sensible Resistente 0,250,51-2 ? 4 FQaAGbER c CDd Negativo I Multirresistencia y sensibilidad a oxacilina 20 20 0 5 150 0 14 11 17 13 II Sensibilidad intermedia o resistencia a oxacilina 16 15 1e 5 10 10 6 3 8 6 Positivo III Heterorresistencia a oxacilina 11 0 11 0 10 10 9 8 4 4 IV Perfil atípico de resistencia6 0 6 1 0 0 5 1 1 1 0 Fq: fluoroquinolonas; AG:  aminoglucósidos; ER: eritromicina; CD: clindamicina; aAislado resistente a penicilina y oxacilina (Vitek 2), test de difusión en disco de oxacilina: 11 mm (crecimiento en el interior del halo de inhibición). Grupo II Constituido por 16 aislamientos que presentaron un resul- tado de sensibilidad intermedia o resistencia a oxacilina en el sistema Vitek 2 y en el test DD, y eran además mecA negativos. Grupo III Formado por 11 aislamientos heterorresistentes frente a oxacilina. Nueve de los aislamientos se mostraron resis- tentes a oxacilina en el sistema Vitek 2; los dos restantes fueron sensibles. En el test DD de oxacilina todos presenta- ron velos en el interior del halo de inhibición, y además eran portadores del gen mecA. Grupo IV Comprende 6 aislamientos con perfiles atípicos de resisten- cia: cinco aislamientos que fueron solamente resistentes a peni- cilina y oxacilina, y un aislamiento que sólo se mostró resistente a ciprofloxacino y eritromicina. Todos fueron resistentes en el test DD de oxacilina y mecA positivos. RESULTADOS Características de resistencia a oxacilina y otros antimicrobianos no betalactámicos Tal y como se recoge en la tabla 1, la práctica totalidad de los aislados mecA positivos (grupos III y IV) presentaron una CMI de oxacilina ?4 µg/ml, mientras que la mayor parte   de los aislados mecA negativos (26 de un total de 36 ais- lados), de los grupos I y II, presentaron CMI de oxacilina de 0,5-1 µg/ml. Por otra parte, en los grupos I, II y III, todos los aislados fueron resistentes al menos a tres antimicrobianos (no betalactámicos)            pertenecientes a distintas familias. Resultados de sensibilidad en el test de difusión en disco de 30 µg de cefoxitina En todos los casos los halos de inhibición obtenidos en el test de difusión en disco de cefoxitina fueron de fácil lec- tura, puesto que los bordes eran nítidos y no se observaron fenómenos de heterorresistencia ni de crecimiento difuso. Tal como se muestra en la tabla 1, hubo una correlación muy buena entre la presencia o ausencia del gen mecA y la re- sistencia o sensibilidad, respectivamente,  frente a cefoxitina en los aislados estudiados. Solamente hallamos un aislado en el grupo II que carecía del gen mecA, fue resistente a penicilina y oxacilina tras su estudio en Vitek 2, mostró un halo intermedio (11 mm) en el test DD de oxacilinay mostró un halo de 20 mm en el test DD de cefoxitina, lo que determinaría su clasificación como resistente según las normas CLSI 2007. DISCUSIÓN Laresistencia a meticilina (RM) en S. aureus se asocia con la producción de un proteína alterada, PBP2a, codificada por el complejo génico mecA. En los últimos años se han propues- to numerosos métodos de detección de dicha alteración1,2. To- dos ellos pretenden detectar la resistencia a meticilina de cualquier aislado de S. aureus incluyendo aquellos que mues- tran un fenotipo heterogéneo de resistencia, los que tienen Evaluación del método de difusión en disco de 30 µg de cefoxitina en la detección de resistencia a meticilina en aislamientos seleccionados de Staphylococcus aureus N. Batista, et al. 25 215 Rev Esp Quimioter 2008;21(4):213-216
una resistencia a oxacilina de bajo nivel, así como diferenciar los verdaderos S. aureus RM de los borderline. La técnica que ha mostrado resultados de sensibilidad mayores del 90% es la de aglutinación de látex que detecta la PBP2a, y aunque es un método rápido, supone un coste apreciable1,2. El método de referencia para la detección de RM es el estu- dio del gen mecA, que hoy se halla limitado a los laboratorios de microbiología de referencia, y no es aplicable a la práctica diaria. La cefoxitina es una cefamicina que actúa como un inductor    más fuerte que la oxacilina sobre la producción de PBP2 en aislados de S. aureus que poseen el gen mecA; por lo tanto pa- rece más eficaz que la oxacilina en la detección de la resisten- cia a meticilina mediante el test DD, al menos en aquellas po- blaciones de S. aureus que son heterorresistentes5. Fue en el año 2001 cuando Mougeot et al.3propusieron por primera vez la utilización del test DD de cefoxitina co-

Síguenos

Utilizamos cookies propias y de terceros para mejorar la experiencia de navegación, y ofrecer contenidos y publicidad de interés. Al continuar con la navegación entendemos que se acepta nuestra política de cookies.

X