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Efectos de la dexametasona sobre la inmunomarcación renal de ...

Resumen: V-037 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Efectos de la dexametasona sobre la inmunomarcación renal de mioglobina en ratas ...

Enviado* el 31/12/2010 18:12
Resumen: V-037 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Efectos de la dexametasona sobre la inmunomarcación renal de mioglobina en ratas intoxicadas con veneno de Bothrops neuwiedii diporus. Koscinczuk, Patricia1* - Dallard, Bibiana2 - Ortega, Hugo2 - Rossiani, Adriana1 - Borda, Toribio1 1.Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional del Nordeste. Sgto Cabral 2139- 3400- Corrientes. 2. Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional del Litoral. Esperanza. Santa Fe Antecedentes El envenenamiento por Bothrops sp produce efectos locales y sistémicos que se desarrollan simultáneamente.  Las lesiones locales incluyen edema, dolor, eritema, equimosis, bullas cianóticas, necrosis y celulitis. Si bien estas lesiones son muy manifiestas y llaman la atención de las personas no preparadas en el tema, no están relacionadas con una alta tasa de mortalidad. De hecho, la causa de muerte en estas intoxicaciones son las coagulopatías en cerebro, pulmón y falla renal aguda (FRA) secundaria a necrosis tubular aguda o a glomerulonefritis (Amaral, et al., 1985; da Silva, et al., 1979;; Amaral et al., 1986; Boer-Lima, et al., 1999; Boer-Lima, et al., 2002 Secretaria de Saude do Estado de Sao Paulo, 1993; Rezende, et al., 1989). Diversos trabajos realizados sobre tejido muscular inyectado con veneno botrópico describen mionecrosis (Gutierrez y Lomonte, 1994; Lomonte et al., 1993). Esta mionecrosis podría asociarse a fenómenos de rabdomiólisis (VanHolder et al., 2000). Si así fuera, deberíamos contemplar no solo el daño directo que el veneno puede producir sobre el tejido renal (Boer Lima et al., 1999; Boer Lima et al., 2000), sino también la fisiopatología  producida por la mioglobina liberada a partir del músculo dañado (Ponraj D & Gopalakrishnakone P, 1996). El principio terapéutico del accidente ofídico incluye el antisuero específico, pero si consideramos a la mioglobinuria como una complicación clínica deberíamos tenerla en cuenta al momento de planificar un tratamiento adecuado. Esto no siempre sucede, ya que muchas veces el dolor y edema local es tan intenso que, con frecuencia, la dexametasona forma parte de las indicaciones médicas ya sea por sus efectos antiinflamatorios, o para prevenir las posibles reacciones de hipersensibilidad. En este trabajo, mediante la técnica de inmuohistoquímica, se compara el comportamiento de la mioglobina en ratas intoxicadas con veneno de B. Neuwiedii diporus tratadas con dexametasona  respecto al de ratas intoxicadas sólo con veneno. Materiales y métodos Para valorar los efectos que la dexametasona pudiera tener sobre la inmunomarcación de mioglobina en el tejido renal durante el accidente ofídico con veneno de Bothrops neuwiedii diporus,  se trabajó ratas machos de la cepa Wistar de 280 ± 20 g de peso.  El veneno fue obtenido por extracción manual, desecado en campana de vacío y mantenido a -20ºC hasta el momento de su utilización. La dosis de inoculación fue de 700 µg de veneno en 0.2 ml de solución fisiológica aplicado por vía intramuscular en los dos grupos estudiados. El grupo 2, 30 minutos antes de la inoculación del veneno, se trató con 20 µg dosis total de dexametasona por vía intramuscular. El grupo control fue inoculado con 0.1 ml de solución salina normal. En las dos experiencias se conformaron 6 grupos de 5 ratas cada uno (n=30) con los siguientes tiempos de exposición: 3,  6, 12 y 24 horas, 1 y 4 semanas. Para obtener las muestras de orina, sangre, tejidos muscular y renal, los animales fueron sacrificados mediante dislocación de la articulación atlanto occipital, previa anestesia con 0,3 ml/ 200 g de peso de una dilución de 6 g de hidrato de cloral en 30 ml de agua destilada, aplicados por la vía intraperitoneal. La expresión de mioglobina en riñón se evaluó mediante inmunohistoquímica usando anticuerpo policlonal (BioGenex). Para la marcación se utilizó el método estreptavidina-peroxidasa (Histostain-SP Peroxidase Bulk Kits-Zymed, USA) y 3,3 diaminobenzidina (Liquid DAB-Plus Systrae Jut-Zymed, USA) como cromógeno. Mediante análisis digital de imágenes se calculó el porcentaje de área inmunomarcada. Los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA). Discusión de los resultados Una revisión de la bibliografía respecto al uso de los esteroides en el envenenamiento ofídico aporta poca información sobre sus indicaciones y contraindicaciónes. Las opiniones están divididas, mientras que algunos trabajos mencionan la posibilidad de sobreinfecciones en el lugar del accidente ocasionadas por el uso de corticoides
Resumen: V-037 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 parenterales, otros reportan pocos efectos adicionales sobre estas lesiones ( Hudelson & Hudelson, 1995). No obstante, los autores que trabajaron con edema local e hiperalgesia reconocen efectos positivos sobre estos signos clínicos (Carneiro et al., 2002). De todas maneras, deberíamos evaluar el efecto que estos esteroides podrían tener sobre los pacientes considerando las alteraciones sistémicas. De hecho, en algunos accidentes ofídicos se observan orinas rojas (Koscinczuk et al., 2001). Varios autores que estudiaron la fisiopatología del accidente botrópico, sugirieron la posibilidad de hematuria y/o hemoglobinuria (Jorge & Riveiro, 1990; Boer Lima et al., 1999). En las serpientes marinas (Sitprija & Boonpucknavig,  1999) y en el caso particular de Pseudechis australis (Ponraj y Gopalakrishnakone, 1995) se ha asociado la falla renal con  mioglobinuria. En el año 1996, Ponraj y Gopalakrishnakone establecieron un modelo animal para la mioglobinuria utilizando la miotoxina del veneno de Pseudechis australis en ratones, el cual podría ser utilizado para estudiar el mecanismo de rabdomiólisis, mioglobinuria y falla renal (Ponraj y Gopalakrishnakone, 1996). En estos casos la citotoxicidad que afecta a las células epiteliales tuburares renales no sólo estarían relacionados con la injuria celular directa producida por las miotoxinas (Gutierrez y Lomonte, 1994; Lomonte et al., 1993;  Boer Lima et al., 1999), sino también con la acción propia de la mioglobina alterando la estructura celular (Zager, 1996; Moore et al., 1998). El riñon es el principal sitio de clearance y degradación de mioglobina. Se ha comunicado la presencia de dos receptores endocíticos epiteliales, megalina y cubilina, que son los que median el secuestro  de hemoglobina y mioglobina a nivel tubular (Gburek et al., 2002) permitiendo la internalización por endocitosis de estas moléulas (Knochel, 1999). En nuestro trabajo hemos observado que, en los dos grupos tratados, la marcación para mioglobina resultó positiva a las tres horas. La expresión de mioglobina se asoció a la membrana glomerular, las células epiteliales tubulares de los túbulos contorneados proximales y rectos proximales y a la luz tubular.  A las seis horas, se observaron acúmulos en el dominio apical de las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales que coincidieron con áreas de necrosis. Para las 24 horas, la presencia de mioglobina fue más intensa en la zona medular, encontrándose también en asa de Henle, túbulos contorneados distales y colectores. En todos los casos el porcentaje de inmunomarcación para mioglobina fue mayor en el grupo tratado con dexametasona, con diferencias significativas entre los grupos tratados  y de estos con respecto a los controles (p<o.o5) (Foto 2, 3). Si bien Havt et al.,(2001) trabajando con riñon aislado de ratas intoxicadas con veneno de B. Jararacussu demostró que el uso de corticoides no altera la funcionalidad renal  y Martins et al., (1998) reporta que esta droga disminuye las alteraciones de algunos parámetros de filtración glomerular durante el accidente ofídico por Crotalus durissus cascavella, en nuestras observaciones vemos que la inmunomarcación renal de mioglobina aumenta en intensidad  en los tres primeros tiempos y su presencia se prolonga hasta más de 24 horas. (Fig.1 y 4) .  Una de las hipótesis postuladas para explicar el daño que la molécula de hemo ejerce sobre las células epiteliales tubulares es que luego de ser captada intacta por los lisosomas, y debido a su  pH suficientemente bajo, es capaz de escindirse en sus componentes, globina y ferrihemato (Knochel, 1999). Este último es sacado de las células tubulares, con consumo de ATP. En presencia de isquemia renal, de hipoxia o en situaciones de reducción extrema de las reservas de ATP, responsable del transporte, se produce una lesión celular probablemente por liberación de radicales libres. Para explicar esta injuria por oxidación  se ha sugerido que la mioglobina libera hierro libre (Fe 2+), el cual puede inducir a peroxidación lipídica  como resultado de la generación de radicales  hidroxil vía la reacción de Fenton (Zager, 1996). Otro mecanismo alternativo sugerido por otros  autores es que el grupo heme de la misma molécula podría hacer ciclo redox entre diferentes estados de oxidación, promoviendo la peroxidación lipídica como consecuencia de su habilidad para descomponer los hidroperoxidos lipídicos a radicales  peroxil y alkoxil (Moore et al.,  1998). De esta manera, la porción férrica del ferrihemato puede generar radicales superóxidos tóxicos. El citocromo P450 puede ser la fuente de hierro que cataliza la formación de estos productos. Para explicar la probable acción que los esteroides sobre el metabolismo de la mioglobina en las ratas intoxicadas con veneno de B Neuwiedii diporsus podríamos sugerir la actividad supresora que la dexametasona tiene sobre la heme oxigenasa-1 (HO-1), una proteína de estrés que participa en los mecanismos contra agentes que promueven la injuria de oxidación tales como las endotoxina o el hemo (Deramaudt et al., 1999). El sistema de hemo oxigenasa cataliza la degradación de la molécula de hemo  a biliverdina y hierro, con la liberación de monóxido de carbono. La biliverdina se convierte luego en bilirrubina por la enzima citosólica, reductasa de biliverdina.La inducción de hemo oxigenasa puede específicamente disminuir al hemo celular (pro-oxidante) y elevar los niveles debilirrubina (antioxidante) (Deramaudt et al., 1999). Otra explicación estaría relacionada con la actividad de los esteroides sobre el catabolismo y el transporte de aniones orgánicos que pueden potenciar la injuria tubular isquémica (Zager, 1996).
Resumen: V-037 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Conclusiones Si bien no se puede descartar el daño renal producido por acción directa del veneno, se observa la participación que la mioglobina tiene sobre el desarrollo de estas lesiones, con una mayor inmunomarcación en aquellas ratas pretratadas con dexametasona. Bibliografía Amaral, C.F.S.; da Silva, O.A.; Godoy, P.; Miranda,  D.  1985. Renal cortical necrosis following Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu snake bite. Toxicon. 23: 877-885. Amaral, C.F.S., Rezende, N.A., Silva, O.A. Ribeiro,  M.M.F., Magalhaes, R.A., Reis, R.J. Carneiro, J.G. , Castro, J.R.S. 1986. Insuficiencia renal aguda secundaria a acidente ofídico botrópico e crotálico. Analise de 63 casos. Rev. Inst. Med.Trop.S.Paulo. 28: 220-227. Boer Lima, P.A.; Rocha Gontijo, J.A.; Da Cruz-Hofling M.A.  1999. Histologic and functional renal alterations caused by Bothrops moojeni snake venom in rats. Am.J.Trop. Med. Hyg. 61: 698-706. Boer Lima, P.A.; Rocha Gontijo, J.A.; Da Cruz-Hofling M.A. 2002. Bothrops moojeni snake venom-induced renal glomeruli changes in rat. Am.J.Trop. Med. Hyg. 67: 217-222. Fig. 3:Corte histopatológico de riñón de ratas inoculadas con 700µg de venenos de B. Neuwiedii diporus  y  dexametasona. Tiempo de exposici{on 3 hs. Se observan cilindros pigmentrios positivos a mioglobina. (Inmunohistoqu{imica 400X) Fig. 4: Corte histopatológicos de riñon de ratas inoculadas con  700µg  de veneno de B.neuwiedii diporus y dexametasona. Tiempo de exposición 24 hs. Se observa la presencia de mioglobina en las células epiteliales tubulares.  (nwuiInmunohistoquímica 400) Fig. 1: Muestras de orinas de ratas 24 horas después de iniciado el tratamiento. Observese el color rojizo que aún mantienen Fig. 4: Corte histopatológicos de riñon de ratas inoculadas con 700µg  de veneno de B.neuwiedii  diporus y dexametasona. Tiempo de exposición 24 hs. Se observa la presencia de mioglobina en las células epiteliales tubulares. (nwuiInmunohistoquímica 400)
Resumen: V-037 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Carneiro, A.S.; Ribeiro, O.G.; de Franco, M., Cabrera, W.H.K.; Vorraro, F.; Siquiera, M.; Ibáñez, O.M. ; Starobinas, N.  2002. Loca inflammatory reactions induced by Bothrops jararaca venom differs in mice selected for acute inlammatory response. Toxicon 40: 1571-1579. Deramaudt, T.B.; da Silva, J.L.; Remy, P.; Kappas, A.; Abraham, N.G.  1999. Negative regulation o human oxygenase in microvessel endothlial cells by dexametasone. Proceedings of the society for experimental biology and medicine 222:185-193. Gburek, J., Verroust, P.J., Willnow, T.E. Fyfe, J.C., Nowacki, W., Jacobsen, C. Moestrup, S.K, Christensen, E.I. 2002. Megalin and cubilin are endocytic receptors involved in renal clearance of hemoglobin. J Am Soc Nephrol. 13:423-430. Gutiérrez, J.M.; Lomonte, B.  1995. Phospholipase A myotoxins from Bothrops snakes venoms. Toxicon. 33: 1405- 1424. Havt, A., Fonteles, M.C., Monteiro, H.S.A..2001. The renal effects of Bothrops jaraacussu venom and the role of PLA 2 and PAF blockers. Toxicon. 39: 1841-1846. Hudelson, S.; Hudelson, P. 1995. Pathophysiology of snake envenomation and evaluation of treatments. Part III. Continuing education 17: 1385-1393. Jorge, M.T., Ribeiro, L.A.  1990. Accidentes por serpentes peconhentas do Brasil. Rev. Assoc med Bras. 36:66-77. Knochel, J.P.  1999. Nefropatía por pigmentos.  En: Greenberg,A. (Ed) Tratado de las enfermedades renales, 2ºEd. Harcourt Brace. Bacelona. pp. 282-286. Koscinczuk, P.; Leiva, L., Maruñak, S.; Acosta de Pérez, O.A. 2001. Identificación de pigmentos urinarios en la intoxicación de ratas con veneno de Bothrops neuwiedii mediante cromatografía de filtración molecular.  Sesión de Comunicaciones científicas de la Secretaría de Ciencia y Técnica-UNNE. Corrientes, 22 al 26 de octubre, 2001 Lomonte, B.; Tarkowski, A.; Hanson, L.A.  1993. Host response to Bothrops asper snake venom. Analysis of edema formation, inflammatory cells, and cytokine relese in a mouse model. Inflammation. 17: 93-105. Moore, K.P., Holt, S.G., Patel, R.P., Svistunenko, D.A. Zackert, W., Goodlert, D., Reeder, B.J., Clozel, M., Anand, R., Cooper, C.E. Morrow, J.D. Wilson, M.T. Darley-Usmar, V. RobertsII J.  1996. A causative role for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinization in the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis- induced renal failure. The journal of biological chemistry.273: 31731-31737 Ponraj, D., and P. Gopalakrishnakone.  1995. Morphological changes induced by a generalized myotoxin (myoglobinuria-inducing toxin) fom the venom o Pseudechis australis (king brown snake) in skeletal muscle and kidney of mice. Toxicon. 33: 1453-1465. Ponraj D, Gopalakrishnakone P. 1996. Establishment of an animal model fo myoglobinuria by use of a myotoxin from Pseudechis australis (King Brown snake) venom in mice. Lab. Anim. Sci. 46: 393-398.. Rezende NA, Amaral CFS, Bambirra EA, Lachatt JJ, Coimbra TM.  1989. Functional and histopathological renal changes induced in rats by Bohrops jararaca venom. Bras J Med Biol Res. 22: 407-416. Secretaria de Saude do Estado de Sao Paulo. 1998. Accidentes por animais peconhentos. Identificacao, diagnóstico e tratamento.Manual de Vigilancia Epidemiológica. Sao Paulo. Brasil. Siprija V, Chaiyabutr N.. 1999. Nephrotoxicity in snake envenomation. Nat.Toxins 8: 271-277. VanHolder R, Sever MS, Erek E, Lameire N.  2000. Rhabdomyolysis. J Am Soc Nephrol 11: 1553-1561. Zager, R.A.  1996. Rhabdomyolysis and myohemoglobinuic acute renal failure. Kidney International. 49: 314-326.

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