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Cinética de células primitivas hematopoyéticas movilizadas por acción del Paclitaxel Aguirre Ojea María F. - Juaristi, Julián A. - Aguirre, María V. - Alvarez, Mirta A ...

Enviado* el 01/01/2011 01:25
Cinética de células primitivas hematopoyéticas movilizadas por acción del Paclitaxel Aguirre Ojea María F. - Juaristi, Julián A. - Aguirre,  María V. - Alvarez,   Mirta A. - Lattman,  Alejandro* Romero Benítez,  María M. - Espada,  Tracy N. - Piñeyro,  Shirley - Brandan,  Nora C. Cátedra de Bioquímica. INFIBAR - Facultad de Medicina - UNNE. Mariano Moreno 1240 - (3400) Corrientes - Argentina. Tel./Fax: +54 (03783) 435378 E-mail: [email protected] * Servicio de Clínica Médica - Hospital Escuela - Corrientes. ANTECEDENTES Las células primitivas hematopoyéticas (CPH) tienen capacidad de auto renovación y además pueden generar los progenitores de los diferentes linajes sanguíneos (1). Estas características tienen gran impacto en el área clínica por la posibilidad de reconstituir la hematopoyesis con posterioridad al tratamiento quimioterápico (2). Esto ha llevado a explorar en modelos experimentales (3), la movilización de CPH, su tránsito por sangre periférica y su capacidad funcional para generar progenitores multipotentes. Ciclofosfamida ha sido uno de los citotóxicos más empleados para la movilización de CPH en pacientes oncológicos. Sin embargo, de acuerdo a estudios previos, presenta como efecto adverso una potente acción inmunosupresora  (4) por su efecto sobre los linfocitos T. Una acción sinérgica de la movilización de CPH se logra utilizando Factor Estimulante de Granulocitos (G-CSF). De manera tal, que los protocolos más utilizados en la actualidad para la obtención de CPH en sangre periférica incluyen Cy, G-CSF o su uso combinado (5). Sin embargo, su efecto sobre las células inmunocompetentes es menos conocido, por lo que aumenta el riesgo de que células residuales puedan estén presentes en el inóculo y que la recurrencia de la patología pueda persistir luego del transplante de CPH. Consecuentemente, se hace importante en el campo de la oncohematología experimental, la identificación de agentes movilizadores de CPH que, sin afectar al sistema inmune, mantengan una efectiva actividad antitumoral. Paclitaxel (PTX) ha demostrado su eficacia en un importante número de neoplasias, incluyendo al cáncer de mama y de ovario (6). Realiza su acción mediante dos mecanismos. Un efecto directo sobre la mitosis por estabilización de los microtúbulos que lleva a la necrosis, y otro indirecto, mediado por citoquinas provenientes de los macrófagos que inducen la apoptosis, lo que podría tener influencia sobre la función inmune.  Recientemente, mostramos que PTX afecta la hematopoyesis produciendo, además del daño en la serie mieloide, profundos cambios en la serie eritroide, pero sin evaluar los efectos que provoca sobre la población linfoide (7). Basados en estas observaciones, este trabajo estudia la capacidad del PTX para movilizar las CPH en un modelo murino, analizando la cinética, las características funcionales de las células movilizadas y la inducción de la apoptosis. MATERIALES Y METODOS Animales y CPH movilización:  Se utilizaron ratones adultos isogénicos de la cepa CF1 (26 - 28 g), provistos por el Bioterio de la Facultad de Medicina, UNNE. Se los agruparon en cajas de 5 a 10 animales, con alimento standard y agua ad libitum. Paclitaxel (Taxol, Bristol Myers Squibb) se administró vía IP en una concentración de 29 mg/ kg. Estudios previos demostraron que los CPH inducidos por PTX son movilizados a  sangre periférica y bazo (3), y que el número de células formadoras de colonias hemopoyéticas (CPH) movilizadas al bazo, son mayores que en la sangre periférica, exhibiendo estos compartimentos, un patrón de cinética  similar. Obtención de CPH movilizados: Los ratones inyectados con PTX fueron sacrificados 0, 2, 5, 7 y 10 días después de la quimioterapia, y a partir de bazo se obtuvieron células mononucleares, quienes fueron lavadas dos veces con alfa medio suplementado, contadas y testeadas para la viabilidad por la técnica de exclusión del Trypan Blue (Sigma Co). Estas células fueron usadas como CPH en las experiencias subsecuentes. Determinación de la celularidad esplénica: Se obtuvieron muestras de células nucleadas esplénicas de los lotes tratados con PTX a los días 0, 2, 5, 7 y 10 post-tratamiento. Las muestras de esplenocitos se obtuvieron a través de malla estéril con 500 ?l PBS buffer (137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO412H 2 O), utilizando diluciones en solución de Turk, realizando los cálculos acordes con lo referido en la bibliografía. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado contra lotes control. Los resultados se expresan como promedio de células/ bazo x 106 (± SEM).
Determinación de Apoptosis por Microscopía Óptica: Se realizaron extendidos de suspensiones esplénicas a cada día del esquema experimental. Los preparados teñidos con May - Grunwald - Giemsa fueron examinados discriminando las células apoptóticas por las características morfológicas nucleares y citoplasmáticas: fragmentación nucleolar, vacuolaciones e irregularidades plasmáticas. Se contaron las células apoptóticas en 100 células totales por preparado, evaluándose 3 preparados en cada día del esquema experimental. Los resultados se expresan como porcentajes promedio ± SEM. Cuantificación de las células primitivas hematopoyéticas (CPH): El número de progenitores hemopoyéticos en la población normal o CPH movilizados por PTX en sangre periférica y esplenocitos, fueron cuantificados en ensayo clonogénico, para determinar el número de Unidades Formadoras de Colonias en Cultivo (CFU-C).  La población de CPH obtenida de esplenocitos o sangre periférica se cultivaron a una concentración de 2 x 106 células/ ml en un medio semisólido de metilcelulosa (0,8%) , que fue suplementado con 10 % de suero fetal (FBS) (SERGEN), 2 U/ml de eritropoyetina recombinada (SIDUS) y suero murino rico en GM-CSF (2,5%). 0,5 ml de cultivo fue establecido por triplicado, en microplacas estériles de 24 wells (Costar, USA) e incubados a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de CO 2 . Al día 7, se identificó bajo Microscopio Invertido (Olympus) el número total de colonias con > 40 células (CFU-C), que incluyen: CFU- granulocito-macrófago (CFU-GM), BFU-eritroideo (BFU-E) y CFU-mixtas (CFU-GEM). El número total de CFU-C movilizadas al bazo fueron calculados usando el número de células nucleadas esplénicas. Cálculos estadísticos: Los resultados fueron analizados con el test de Newman - Kewls utilizando el software INSTAT y PRISM versión 3.0 (Graph Pad Software. San Diego, CA, USA), considerando significativo a partir de p< 0.05. DISCUSION DE RESULTADOS Acción de Paclitaxel sobre células nucleadas esplénicas El total de células mononucleares esplénicas y el porcentaje de apoptosis fueron determinados 0, 2, 5, 7 y 10 días después de la administración de PTX  (29 mg/ kg). Los resultados de estas experiencias se muestran en la  figura 1. La administración de PTX estuvo asociada con una declinación en el número de las células nucleadas obtenidas del bazo a partir de día 2 hasta el día 7, recuperándose el número total de células esplénicas al día 10, retornando a valores normales. Simultáneamente,  se determinó el porcentaje de células en apoptosis, correlacionándose con el descenso del número total de esplenocitos. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 50 150 250 ** ** * 0 2 4 6 8 10 *** *** Dias Post-Paclitaxel Cél. Nucleadas Totales Bazo x10 6 Apoptosis (%) Cuantificación de las diferentes líneas celulares Cuando  se cuantificaron a las diferentes líneas celulares maduras se evidenció que tanto la línea eritroidea (p < 0.001) como la mieloidea están profundamente afectadas  a partir del segundo y hasta el séptimo día, recuperándose la línea mieloide al día 10 (p < 0.001) mientras que la eritroidea permanece deprimida. Con respecto la línea linfoidea, ésta decae entre el quinto y séptimo día tan solo un 20% respecto al control, volviendo al décimo día a valores normales similares a los basales. En la figura 2 se evidencia que la población linfoidea es la menos afectada después del tratamiento con paclitaxel. Figura 1 Células nucleadas totales ( ) recuperadas  y porcentaje de apoptosis ( ? ) después de la administración de Paclitaxel. Ratones tratados al día 0 con 29 mg/kg de PTX (equivalente a la dosis humana de 97 mg/m2). Los resultados son expresados como la media (x 106) del SEM de tres diferentes experiencias (5 ratones/ lote). *p <0.05  **p <0.01 *** <0.001.
0.0 2.0 5.0 7.0 10.0 0 100 200 mieloide eritroide linfoide *** * *** *** *** ** ** Días Post-Paclitaxel Cél. Nucleadas Totales x10 6 Progenitores Hematopoyéticos en HPC movilizados Los progenitores hematopoyéticos son movilizados a sangre periférica y bazo. Una comparación de CFU-C obtenidas en sangre periférica y bazo de poblaciones de CPH en los días subsiguientes al citotóxico es mostrada en la tabla 1.        Tabla 1: Número de CFU-C en sangre periférica versus esplenocitos tratados con PTX Agente Fuente de CPH Día 0 Día 2 Día 5 Día 7 Día 10 Paclitaxel Células esplénicas Sangre Periférica 96.45 ± 4.05 ND 572.6 ± 84 45.0 ± 4.0 2059 ± 197 60.5 ± 2.5 28.6 ± 5.3 1.5 ± 0.5 30.7 ± 8 2.0 ± 0 CPH son procesadas a partir de sangre periférica y bazo murino en los días indicados, después del tratamiento con PTX. El número de progenitores fueron ensayados en metilcelulosa durante 7 días. El número de CFU-C/ 2 x 106 de células sembradas representan los resultados de tres experiencias diferentes (SEM±). En cualquiera de los días, el número de CFU-C es mayor en las células esplénicas que en sangre periférica.  PTX lleva a una rápida movilización, que se evidencia  a partir del día 2 (p < 0.001) con un pico de actividad significativa de CHP al día 5 (p < 0.001). Estos datos y observaciones en estudios previos sugieren; que el número de células hematopoyéticas primitivas movilizadas al bazo es significativamente mayor que la de sangre periférica, siguiendo una cinética similar. Basado en estos resultados, podemos asumir que, en el modelo murino, el bazo como fuente de CPH es más eficiente que la sangre periférica. El número de progenitores hematopoyéticos (CFU-C) en HPC movilizados por PTX es representado en la figura 3. 0.0 2.0 5.0 7.0 10.0 0 1000 2000 3000 *** *** * * Días post-tratamiento con Paclitaxel Total CFU-C 2 x 10 6 células Figura 2 Cambios en el recuento de células mieloideas, eritroideas y  linfoideas en esplenocitos murinos post- tratamiento con PTX. El recuento de células absolutas de las tres líneas fue calculado a partir de células nucleadas totales (x 106) y el porcentaje diferencial. Datos fueron obtenidos a partir de tres ensayos (6 - 10 ratones/ lote). *p <0.05  **p <0.01  ***p < 0.001. Figura 3 Cinética de las células primitivas hematopoyéticas (CPH) movilizadas después de la administración de Paclitaxel. El curso en el tiempo de las CPH movilizadas después de la administración de 29 mg/kg de PTX fue ensayado en cultivos clonogénicos, por el recuento del total de Unidades Formadoras de Colonias (CFU-C) después de 7 días de incubación, incluyendo todas las colonias con > de 40 células CFU-GEM, CFU-GM y BFU-E. De acuerdo a la morfología predominaron los progenitores hematopoyéticos tempranos (CFU-GEM) (87 - 98%). Los resultados se expresan como CFU-C totales/ bazo/ 2 x 106 ± SEM de tres ensayos realizados por cuadruplicado. *p <0.05 *** p <0.001 indica las diferencias significativas entre cultivos post - PTX y el control.
En condiciones fisiológicas, sólo unos pocos CFU-C se observaron en la población de esplenocitos.  En los animales tratados con PTX  se produce un marcado incremento en el número de CFU-C (CPH) obtenidas a partir del día 2 (p < 0.001), llegando a ser máximas al quinto día (p <0.001) y luego disminuyen por debajo de los valores control (p < 0.05). En los resultados que se muestran en la figura 3 se evidencia la movilización rápida de CPH observada a partir del día 2 con un máximo al quinto día en los animales tratados. Estos resultados sugieren que el PTX lleva a una eficiente y rápida movilización de CPH, con menor compromiso de la población linfoidea. CONCLUSIONES  El descenso del número total de esplenocitos se evidencia a partir del día 2 hasta el día 7 post- tratamiento con PTX, retornando a valores normales al día 10. El porcentaje de apoptosis que se observa entre el quinto y séptimo días, se correlaciona con el descenso del número de células totales.  En la cuantificación morfológica de esplenocitos post- PTX se observa  que la población linfoidea es la menos alterada con relación a la eritroidea, que es la más afectada, mientras que la mieloide lo es en menor grado. En condiciones fisiológicas, las células hematopoyéticas progenitoras primitivas, por la acción del PTX, son movilizadas hacia la sangre periférica, en un tránsito corto, mostrando una migración acentuada hacia el bazo. El número total de CFU-C en células esplénicas representan a los CPH movilizados, evidenciando este fenómeno a partir del día 2, sin alterar la población linfoidea. Al día 5 se recupera el mayor número de células hematopoyéticas progenitoras primitivas evaluadas como CFU-C totales, exhibiendo sólo un 20% de disminución en la población linfoidea. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS (1) Ogawa M.  Differentiation  and  proliferation  of  hematopoietic  stem  cells. Blood 1993;  81: 2844. (2) To L B, Haylock D N, Simmons P J, Juttner C A. The Biology and Clinical Uses of Blood Stem Cells. Blood 1997; 89: 2233. (3) Verma U N, Yankelevich B, Hodgson J, Mazumder A. Effect of the in vitro priming for peripheral blood stem cells (PBSC) mobilization on in vitro generation of citotoxic effectors by IL-2 activation of PBSC in a murine model. Bone Marrow Transplant 1997;  19: 529. (4) Mizoguchi H, O´ Shea J J, Longo D L, Loeffler C M, Mac Vicor D W, Ochoa, A C. Alteration in signal transduction  molecules in T- lymphocytes from tumor- bearing mice.  Science 1992; 258: 1795. (5) Webb I J, Eicknoff C E, Elias A D, Ayash L J, Wheeler C A, Schwartz, G N, Demetri, G D, Anderson, K C. Kinetics of peripheral blood monuclear cell mobilization with chemotherapy and/or granulocyte-colony- stimulating factor: implication for timing and yield of hematopoyetic progenitor cell collection. Transfusion 1996; 36: 160. (6) Arbuck S G. Paclitaxel: current developmental approaches of the National Cancer Institute. Semin Oncol 1995; 22: 55. (7) Juaristi J A, Aguirre M V, Carmuega R, Romero Benitez M, Alvarez M, Brandan N. Hematotoxicity induced by Paclitaxel: in vitro and in vivo assays during normal murine hematopoietic recovery. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2001; 23: 161.

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