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Análisis ELISA para la determinación cuantitativa de ...

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Enviado* el 01/01/2011 01:28
!"#$%&'%"#(% Análisis ELISA para la determinación cuantitativa de progesterona en suero o plasma humano !)*+*,-./01, !"#$% 55020 96 determinaciones  Estuche completo !&'(% 2+345)*60+-3 Progesterona (Pregn-4-en-3, 20-dion) es una hormona esteroide C 21 con un peso molecular de 314,5 Dalton. Es el gestágeno natural más importante, producido por el corpus luteum en mujeres no embarazadas y por la placenta en embarazadas. En cantidades reducidas se encuentra en los testes de hombres y en la corteza suprarrenal de hombres y mujeres. Progesterona regula durante el ciclo de menstruación junto con Estrógenos (en especial Estradiol) órganos asociados. Una función importante es la regulación de la transformación del endometrio al inicio del embarazo así como el mantenimiento del endometrio. La progesterona circulante en el sistema sanguíneo está ligado en un 90-98% a proteínas portadoras (CBG, SHBG) y albúmina. La parte restante, la progesterona libre, es la forma activa del esteroide. Los valores de progesterona en la sangre varían fuertemente en dependencia de las fases del ciclo de menstruación. Los valores reflejan las actividades de los ovarios y del Corpus Luteum, de tal manera que la relevancia de la determinación de progesterona puede verse en la comprobación de la ovulación y en mujeres no embarazadas en el dictámen de la función del Corpus Luteum1. Puede comprobarse una secreción anormal de progesterona durante la fase premenstrual, en insuficiencia luteal, dismenorrea y en el rechazo retardado del endometrio 2, 3, 4, 5 . !)0,/0503 744%894:3;5*-0-063447 El análisis PROGESTERONE ELISA se basa en la interacción competitiva de progesterona de la muestra y un conjugado enzimático-hormonal por una limitada cantidad de anticuerpos (conejo) anti-progesterona inmovilizados. Por eso la cantidad de conjugado hormonal-enzimático ligada es inversamente proporcional a la concentración de progesterona en la muestra. Después de la incubación de la muestra y del conjugado hormonal-enzimático es eliminado por lavado el conjugado no ligado. Con la adición de la solución sustrato (paso 2) se desarrolla un color azul, que se transforma a amarillo después de parar la reacción. La intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración de progesterona de la muestra. La absorbancia de los calibradores y las muestras se determina utilizando un lector  fotométrico de micropocillos ELISA (por ejemplo HUMAREADER). Los valores de concentración de muestras desconocidas se determinan mediante una curva de calibración obtenida con ayuda de calibradores de concentraciones conocidas de progesterona. "*./-063+4<4/3,-*,0=3 !)&*% !)&*% !)&*% !)&*% 12 '0).+4=*4>0/)353/0??3+4@*,453)-. -0).+A Tiras (=060+0B?*+) de 8 pocillos con anticuerpos (conejo) anti-progesterona !*+,% !*+,% !*+,% !*+,% A - G:.?0B).=3)*+4 (tapa blanca) 7x1,0mllistos para usar, en suero humano Concentración de progesterona: 0 (9), 0,3 (C), 1,25 (: ), 2,5 (D), 5,0 (%), 15,0 (E) y 40,0 ($) ng/ml !*-.% !*-.% !*-.% !*-.% 25 ml:3,FGH.=34*,I0;J-0/34.,-KH*,34 (tapa blanca) listo para usar, coloreado rojo Conjugado4Progesterona - HRP pH 6,9 !  0,2 BSA 0,5 % TRIS/MOPS buffer 0,05 mol/l NaCl 0,1 mol/l !/0% !/0% !/0% !/0% 30 ml&3?G/01,4=*4?.6. =34 (tapa negra) Concentrado para aprox. 1200 ml pH 7,3 !  0,1 TWEEN 20 0,2 % TRIS-NaCl-buffer 3,0 mmol/l !012% !012% !012% !012% 25 ml&3?G/01,4+G+-).-34 (tapa amarilla) pH 3,5 - 4,0 listo para usar 3,3', 5,5'- Tetrametilbenzidina (TMB) 0,26 g/l Peróxido de hidrógeno 0,015 % Buffer acetato de sodio 0,05 mol/l DMSO < 5 % !03-4% !03-4% !03-4% !03-4% 14 ml&3?G/01,4=*45.). =.4 (tapa roja) Acido sulfúrico 0,5 mol/l 9H*,-*+45)*+*)6. ,-*+: Concentración total < 0,7% (3-.+4=*4+*HG)0=.= No ingerir los reactivos. Evitar el contacto con los ojos, piel y membranas mucosas. Todas las muestras de pacientes y !*+,% deberían ser manipulados como posibles agentes potencialmente infecciosos. !*+,% han sido encontrados negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1 + 2 en los donantes. Usar ropa protectora y guantes desechables según las buenas prácticas de laboratorio (GLP). Todos los materiales contaminados con muestras o !*+,% deben inactivarse por métodos aprobados (autoclavado o tratamiento químico) según las regulaciones aplicables. !03-4% !03-4% !03-4% !03-4% 4irrita los ojos, la piel y membranas mucosas. En caso de contacto, lavar intensamente con abundante agua y consultar un médico. %+-.B0?0=.= Los reactivos son estables hasta las fechas de expiración señaladas en las etiquetas individuales cuando se almacenan a  2...8°C. Después de abierto los reactivos deben almacenarse a  2...8°C y utilizarse dentro de 60 días (ver también „Nota"). !)&*% !)&*% !)&*% !)&*% -están selladas en un envase de aluminio con un desecante. -Antes de abrir, las tiras deben estar a -*;5*).-G).4.;B0*,-*. -Las tiras no utilizadas deberán ser devueltas al envase con cierre y almacenadas con el desecante. Las tiras almacenadas de esta manera a 2...8°C pueden ser usadas dentro de 60 días (ver "Nota"). ! No tocar el anillo superior o el fondo de los micropocillos con los dedos. !)*5.)./01,4=*4) *./-063+ Todos los reactivos deben estar a -*;5*).-G).4.;B0*,-* (15...25°C) antes del uso. Los reactivos que no están en uso almacenar nuevamente en forma inmediata a 2...8°C. !"#$%&'()*+),-./.0")*+)#.1.*" ) !/+05%!/+05%!/+05%!/+05% -Diluir !/0% a 1200 ml con agua fresca, desionisada en recipiente apropiado. Enjuagar botellita varias veces. -Estabilidad: L.+-.4M4+*;.,.+4.4NOPPPMOQ: . >G*+-). Suero o Plasma EDTA No usar muestras hiperlipémicas o hemolíticas así como muestras que contienen azida de sodio. Muestras pueden ser almacenadas 3 días a 2...8°C o hasta 30 días a -20°C. :3,H*?.)4<4=*+/3,H*?.)4+3?.;*,-*4 G,.46*I. Muestras descongeladas deben ser homogeneizadas. Eliminar el material particulado por centrifugación o filtración. !)3/*=0;0*,-3 &*HG0)4*?45)3/*=0;0*,-34*R./-.;*,-*4/3;34+*4=*+/)0B*P 2",.3)*+)$3" U1: No mezclar o usar componentes de diferentes números de lote. No mezclar tapas de envases (riesgo de contaminación). No usar reactivos despúes de sus fechas de expiración. U2: No usar reactivos que pueden ser contaminados o que tienen aspecto diferente o olen diferentemente que normal. U3: Notar el reparto !*+,% , las muestras y los controles cuidadosamente en la hoja provista en el estuche. U4: !)&*% - sacar el número requerido y colocarlos firmemente en el portatiras. U5: Analizar cada !*+,% , control o muestra por duplicado. Pipetearlos en el fondo de los micropocillos. U6: Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden y tiempo para minimizar diferencias en los tiempos de reacción entre los micropocillos. Es importante para obtener resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no debería exceder de 10 minutos. De lo contrario pipetear la curva !*+,% en las posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la serie. Si se emplea más de una placa, repetir la curva de calibración para cada placa. U7: Evitar/remover burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas de absorbancia. U8: !012% inicia y !03-4% termina una reacción cinética. Evitar la luz intensa durante el desarrollo del color. U9: !)&*% -4 Después de cada pipeteo agitar suavemente durante 20-30 sec. sin verter las soluciones para asegurar una buena mezcla. Si está disponible, mezclar en un mezclador de pocillos (p.ej. HUMAREADER).
Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH Max-Planck-Ring 21  -  D-65205 Wiesbaden  -  Germany Telefon: +49 6122 9988 0  -  Telefax: +49 6122 9988 100  -  eMail: [email protected] ! 4-"%+*&5&+(,")*+)#.1.*" El procedimiento de lavado es crítico . Un lavado insuficiente producirá una mala precisión o absorbancias falsamente elevadas. L1: Aspirar el contenido, agregar !/+05% , aspirar  después de aproximadamente 30 sec. de enjuague y repetir el lavado. L2 : En el caso de lavadores automáticos, se deben cebar con !/+05% y lavar los pocillos 3 veces. Asegurarse que el lavador llene los pocillos completamente y los aspire eficientemente después de 30 sec. (líquido remanente: < 15 µl). L3 : Después del lavado, remover el líquido remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel absorbante. 637$+5.)*+)8&8+, +" Los reactivos y las muestras deberían estar a temperatura ambiente antes del uso. !.+34N !3/0??344ST?U 9NPPPEM$MPPP !*+,%6 A-G; en duplicado 25 -- Muestras, Controles; en duplicado -- 25 !*-.% 200 200 Mezclar Incubar por 60 min. a 20...25°C Lavar 3 veces, como descrito (ver L1/L2 + L3) !/+05% 400 400 !.+34M !012% 200 200 Incubar por 15 min. a 20...25°C (ver U8) !03-4% 100 100 Mezclar cuidadosamente Realizar medición de la Absorción a VOW4,; lo mas rápido posible respectivamente *,4*?4-).,+/G)+34=*4 XW4;0,G-3+ después de haber parada la reacción utilizando una longitud de onda de referencia de 630-690 nm (si disponible). Y.?0=./01,4=*?4. ,J?0+0+ Los resultados pueden ser considerados válidos, si se cumplen los siguientes criterios: Absorbancia Máxima ( !*+,% 9) A " 1,0 El control debe analizarse a 3 concentraciones: Concentración de progesterona a  80% A max = 0,17 -   0,5 ng/ml Concentración de progesterona a  50% A max = 0,82 -   3,8 ng/ml Concentración de progesterona a  20% A max =   8,0 - 28,0 ng/ml :J?/G?3 Para la interpolación de la concentración de progesterona de muestras desconocidas se necesita una curva de calibración (ejemplo ver figura). 1. !*+,% - Graficar sobre papel milimetrado lineal las absorbancias individuales de los duplicados contra la concentración de progesterona respectiva en ng/ml (no promediar las determinaciones de los duplicados). 2. Trazar la mejor curva a través de los puntos del gráfico. 3. Proyectar del eje Y sobre la curva el valor medio de absorbancia (de determinación en duplicado) de la Muestra desconocida (S). Leer sobre el eje X la concentración (ng/ml) correspondiente. 8,-*)5)*-./01,4=*4)*+G?-.=3+ La concentración de progesterona en un paciente no solo puede variar de día en día, sino también de hora en hora. Por lo tanto solamente determinaciones de progesterona en serie pueden garantizar interpretaciones más correctas de los valores determinados en enfermedades ginecológicas o embarazos anormales. Progesterona ocasiona, debido a un efecto termogenético, un aumento de la temperatura basal. La valoración de los valores de progesterona se facilita, si se realiza en relación con una curva de temperatura basal. Los rangos de los valores de progesterona fluctúan desde por debajo de 1 ng/ml en la fase folicular hasta aprox.10-20 ng/ml en la fase luteal (ver tabla de valores normales). Valores máximos son alcanzados 6-8 días después de la ovulación y se mantienen por 4-6 días. 1-2 días antes del sangrado de la menstruación los valores de progesterona vuelven a caer a los valores bajos iniciales. Durante el embarazo sube la concentración de la progesterona placentaria en forma contínua a 200 ng/ml. La determinación sola de progesterona no es suficiente para un diagnóstico. La anamnesis así como exámenes clínicos adicionales, especialmente parámetros diagnósticos (hormonales), deberían tenerse en cuenta. Y.?3)*+4,3);.?*+ Y.?3)*+4=*45)3H*+-*)3,. >GF*)*+4,3);.?*+Z Fase folicular Fase luteal Menopausia 0,2  -   1,4 ng/ml 4    -  25   ng/ml 0,1  -    1   ng/ml L3;B)*+4,3);.?*+Z 0,1  -    1   ng/ml Factor de cálculo: 1 ng/ml = 3,18 nmol/l Cada laboratorio debería determinar sus propios rangos de referencia utilizando los instrumentos/equipos,  métodos de colección de sangre y técnicas de análisis usuales empleados normalmente en dicho laboratorio. :.)./-*)K+-0/.+4=*4?.4*F*/G/01, La sensibilidad analítica del test PROGESTERONE ELISA se encuentra en 0,03 - 0,07 ng/ml de material de muestra. Muestras con una concentración de progesterona mayor a 40 ng/ml deberían ser diluídos con el !*+,%6 9 (0 ng/ml) 1+9 y multiplicarse el resultado por 10. Los datos típicos de ejecución de la prueba pueden ser encontrados en el informe de verificación,  accesible vía www.human.de/data/gb/vr/el-prog. pdf o www.human-de.com/data/gb/vr/el-prog.pdf (3-. Los componentes del estuche son estables hasta la expiración aún después de abiertos. Sin embargo, la posibilidad de una contaminación está directamente relacionada con el número de tomas del reactivo. Por lo tanto, el límite de 60 días en viales abiertos se fijó por razones de seguridad. La manipulación debería siempre estar de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio (GLP*). ¡Los criterios de validación del análisis deben cumplirse siempre! (* Esto incluye:  Colocar la tapa debida en el vial y cerrarlo firmemente / Sacar de los viales de stock solamente los reactivos necesarios para la corrida si entraran en contacto con otras soluciones contaminantes como lo son las muestras, etc. / Las soluciones de stock siempre deben regresarse a 2...8°C si no se usan.) :3,/*,-)./0 1,4!)3H*+-*)3,.4 @,H[;? A 94VOW & \0-*).-G). 1. Israel, R. !"#$%& , Am. J.- Obstet. Gynecol. NNM , 1043 (1971) 2. Soules, M.R. !"#$%& , Fertil. Steril. X], 31 (1981) 3. Maganliello, P.D. !"#$%& , Fertil. Steril. X], 55 (1981) 4. Hahlin, M. !"#$%& , Hum. Reprod. O, 622-626 (1990) 5. Buck, R.H. !"#$%& , Fertil. Steril. OW, 752-755 (1988) EL-PROG INF 5502001 E 06-2004-6

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